基于工程化Un1Cas12f1平台的非经典靶链胞嘧啶碱基编辑技术开发及其应用研究

《Nature Communications》：Noncanonical target-strand cytosine base editing via engineered Un1Cas12f1 platform

本研究针对微型碱基编辑器开发难题，通过计算建模和定点突变技术成功构建高活性enUn1Cas12f1蛋白，并意外发现其具备靶链（TS）编辑能力。研究人员进一步通过丙氨酸扫描筛选获得偏好性TS编辑的切口酶-CBE（TSminiCBE），结合非特异性DNA结合结构域优化后实现在体高效编辑。该研究创建了链选择型微型CBE工具包，为基因治疗提供了新策略。

　　

基因编辑技术的革新始终围绕着精准性、安全性和递送效率三大核心挑战。传统CRISPR/Cas系统因其较大的蛋白尺寸（如SpCas9的1368个氨基酸）严重限制了腺相关病毒（AAV）载体的包装能力，制约了体内基因治疗的应用前景。尽管碱基编辑器（BE）能够在不引起双链断裂（DSB）的情况下实现精准碱基转换，但现有编辑器主要依赖对非靶链（NTS）的编辑，且受限于编辑窗口，基因组覆盖范围有限。

近日《Nature Communications》发表的研究通过深度工程化微型Cas12f系统，成功开发出具有链选择性的微型胞嘧啶碱基编辑器（CBE），不仅显著提升了编辑效率，更意外发现了其靶链（TS）编辑能力，极大扩展了可编辑基因组空间。

研究人员首先采用计算建模和饱和突变策略对Un1Cas12f1进行系统优化。基于蛋白-核酸复合物结构（PDB:7L49），通过Discovery Studio 2019软件预测了529个氨基酸位点突变对复合物稳定性的影响，筛选出31个关键位点进行实验验证。利用切割响应型EGFP报告系统，最终获得三个高效变体：Un1Cas12f1v1.1（DQE3R-S331E）、Un1Cas12f1v1.2（DQE3R-I437R-E447K）和Un1Cas12f1v1.3（DQE3R-S331E-I437R-E447K）。这些变体在HEK293T和HeLa细胞中均展现出显著提升的编辑效率（60-62%），且倾向于产生10-15bp的缺失。

在构建碱基编辑器时，研究团队发现dUn1Cas12f1-evoCDA1不仅能在NTS实现C-to-T编辑，还意外地在TS介导G-to-A编辑。通过系统性评估不同Cas蛋白（dSpCas9、dLbCas12a和dUn1Cas12f1）与多种胞嘧啶脱氨酶（evoCDA1、rAPOBEC1、hA3A(Y130F)和Anc689）的组合性能，证实evoCDA1与Cas12f系统具有最优兼容性。

为增强TS编辑特异性，研究人员通过丙氨酸扫描筛选获得K473A突变体，由此开发的TSminiCBE（enUn1Cas12f1(K473A)-evoCDA1）显著提升TS编辑效率（40%）和产物纯度（80%），同时保持较低indel率（<6%）。机制研究表明，TSminiCBE通过形成NTS切口酶活性，引导细胞修复系统优先安装TS编辑。

进一步融合HMG-D非特异性DNA结合结构域后，HMG-TSminiCBE在12个基因组位点均表现出更优的编辑性能。该编辑器在NTTR PAM序列识别范围上也较原始Un1Cas12f1（TTTR）显著扩展，可编辑基因组空间增加约4倍。

体内实验证实，AAV8递送的enUn1Cas12f1能在小鼠肝脏中高效编辑Ttr基因，使血浆转甲状腺素蛋白水平显著降低。而HMG-TSminiCBE更在Fasn基因成功安装提前终止密码子，展示了其治疗代谢疾病的潜力。

关键技术方法包括：1）基于结构计算的蛋白工程化改造；2）报告基因系统高通量筛选；3）深度测序（NGS）编辑效率分析；4）GUIDE-seq脱靶效应评估；5）小鼠模型（C57BL/6雄性）体内编辑验证。

研究结果系统揭示了Cas12f家族蛋白的动态R-loop特性如何促成TS编辑：Cas12f依赖单个RuvC结构域依次切割NTS和TS的特性，使得PAM远端TS区域可临时形成单链DNA构象，从而为脱氨酶提供底物。这种机制与传统Cas9系统形成鲜明对比，后者通过HNH和RuvC结构域分别切割TS和NTS。

脱靶评估显示，TSminiCBE在DNA和RNA水平均保持良好特异性。全基因组测序（WGS）和转录组测序（RNA-seq）分析表明，其脱靶突变谱与对照组无显著差异。值得注意的是，enUn1Cas12f1虽比野生型具有更高脱靶倾向，但TSminiCBE因其切口酶特性显著降低了DSB相关风险。

该研究的创新性在于：首次发现并验证了Cas12f系统的TS编辑能力；通过理性设计获得高性能enUn1Cas12f1变体；建立链选择性编辑工具TSminiCBE；证实其在体内外的治疗潜力。这些微型编辑器（<530个氨基酸）为AAV介导的基因治疗提供了理想工具，特别适用于需要多基因编辑或组织特异性递送的复杂疾病场景。

研究结论表明，通过深度工程化Cas12f平台并重新利用其内在动力学特性，本研究成功建立了具有链选择性的微型CBE工具包，为精准基因治疗、功能基因组学和合成生物学研究提供了强大技术支撑。这种"一石二鸟"的策略——既提升编辑效率又扩展编辑范围——彰显了计算生物学指导蛋白工程化的巨大潜力，为下一代基因编辑工具开发指明了新方向。