临床粪肠球菌中，由于核糖体蛋白L3的缺失导致利奈唑胺耐药性增强，这一现象在体内发育过程中得以体现

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：In vivo development of elevated linezolid resistance mediated by a deletion in ribosomal protein L3 in clinical Enterococcus faecium

高链霉素（LZD）耐药性由rplC基因缺失引起，导致50S核糖体蛋白L3结构改变，破坏LZD结合位点。菌株1583efm在治疗17天后出现MIC 64 mg/L，且丢失erm(A)、erm(B)、tet(M)等质粒基因，恢复对其他抗生素敏感性。结构建模显示缺失区（Tyr139-Arg159）位于L3与PTC关键区域，影响氢键网络。该突变稳定且伴随显著生长抑制（Fitness cost）。

　　本研究聚焦于一种新型的耐药机制，即通过50S大亚基核糖蛋白L3（RPL3）的缺失导致临床分离的粪肠球菌（*Enterococcus faecium*）对利奈唑胺（Linezolid，LZD）产生高水平的耐药性。这种耐药性在肠道菌群中较为罕见，但在此项研究中，我们发现了一对在一位脑膜瘤患者不同阶段被分离的粪肠球菌菌株，1505efm和1583efm。其中，1583efm是在接受17天利奈唑胺治疗后获得的，其利奈唑胺最小抑菌浓度（MIC）显著升高至64 mg/L，而初始分离的1505efm菌株MIC仅为8 mg/L。同时，1583efm对红霉素、四环素以及高水平链霉素表现出敏感性，这与该菌株失去了多个质粒编码的耐药基因有关，包括*erm(A)*、*erm(B)*、*tet(M)*、*ant(6)-Ia*和*aph(3′)-III*。通过全基因组比较，我们发现1583efm的*rplC*基因存在63个碱基对的缺失，导致其编码的RPL3蛋白缺失了21个氨基酸（ΔTyr139-Arg159）。结构建模分析表明，这一缺失破坏了利奈唑胺在核糖体肽酰转移酶中心（PTC）附近的氢键网络，从而降低了利奈唑胺与核糖体的结合亲和力。这一突变在50代无抗生素培养中保持稳定，但对细菌的生长速度和适应性造成了显著影响，促使菌株对RPL3基因的表达水平升高。本研究揭示了在宿主内，临床分离的粪肠球菌中出现的一种新的利奈唑胺耐药机制，即RPL3的缺失。

利奈唑胺是一种重要的临床药物，广泛用于治疗严重的革兰氏阳性菌感染，特别是多重耐药菌株，如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）以及多重耐药肺炎链球菌（MDR *S. pneumoniae*）。其作用机制是通过与50S亚基的肽酰转移酶中心结合，从而抑制细菌蛋白质的合成。然而，自2000年该药物投入临床使用以来，陆续发现了一些耐药菌株，其中以肠球菌和金黄色葡萄球菌为主。此外，耐药性也出现在凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）及其他细菌中。研究显示，23S rRNA在域V中的突变，尤其是G2576U突变，是肠球菌和葡萄球菌中利奈唑胺耐药的主要机制，尤其是在欧美地区。除了这些rRNA突变外，移动性氧化唑烷酮耐药基因，如*cfr*及其类似基因（编码23S rRNA甲基转移酶）以及*optrA*和*poxtA*（编码ABC-F蛋白家族成员），也被报道与对氧化唑烷酮和酚类药物的耐药性相关。在中国，*optrA*基因的获得是临床肠球菌中利奈唑胺耐药的主要机制，尤其在*E. faecalis*中较为常见，通常介导低水平耐药。

值得注意的是，50S大亚基核糖蛋白的突变，尤其是RPL3和RPL4，也与利奈唑胺耐药有关。RPL3的突变通常与对氧化唑烷酮和大环内酯类药物（如泰乐菌素和替米考星）的耐药性相关，因为它们的结合位点在肽酰转移酶中心（PTC）重叠。此前关于RPL3突变与氧化唑烷酮耐药的研究主要集中在葡萄球菌中，而肠球菌中的此类突变报道较少。本研究发现了一种新的机制，即通过RPL3的缺失（ΔTyr139-Arg159）导致利奈唑胺耐药性增加。此外，我们还探讨了这一缺失对菌株适应性和生长的影响。

为了分析这两株菌株之间的相似性和差异，我们采用了脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术，对它们的基因组进行比较。结果表明，这两株菌株具有相同的PFGE类型，表明它们的基因组高度相似。通过Snippy 4.4.5软件进行单核苷酸多态性（SNP）分析，我们发现它们的基因组之间存在6个变异SNP、1个变异缺失和4个复杂变异。这些变异表明，1583efm可能是在1505efm的基础上进化而来的。进一步的全基因组测序和分析显示，这两株菌株都携带一个染色体和三个环状质粒。在比较质粒时，我们发现1583efm的质粒pUtg2464比1505efm的质粒pUtg1952小约一半，并且缺失了四个关键的耐药基因，包括*ant(6)-Ia*、*aph(3′)-III*、*erm(B)*和*tet(M)*。这表明这些基因的缺失可能是1583efm对红霉素、四环素和高水平链霉素变得敏感的原因。

在染色体层面，我们发现1583efm的*rplC*基因存在63个碱基对的缺失，导致其编码的RPL3蛋白缺失了21个氨基酸（ΔTyr139-Arg159）。这一缺失区域位于RPL3的中央环结构中，而该结构在肽酰转移酶中心附近，可能影响利奈唑胺的结合能力。结构建模分析显示，这种缺失会破坏利奈唑胺在PTC附近的氢键网络，从而降低其与核糖体的结合亲和力。此外，这种缺失还可能干扰关键的肽酰转移反应，如A2451和U2504的相互作用，进而影响利奈唑胺的抗菌效果。

为了验证这一缺失的稳定性，我们对1583efm进行了50代无抗生素培养，获得1583efm_T50菌株。结果显示，1583efm_T50的利奈唑胺MIC与1583efm相同，表明这一缺失在遗传和表型层面均保持稳定。此外，我们通过生长实验发现，与原始菌株1505efm相比，1583efm和1583efm_T50的倍增时间显著延长，从0.76小时增加到1.11小时，且滞后期也从2.7小时延长至4.5小时。这表明RPL3的缺失对菌株的适应性产生了显著的负面影响。

为了进一步探讨RPL3缺失对利奈唑胺耐药性的影响，我们还分析了*optrA*和*rplC*基因的拷贝数和表达水平。结果显示，*optrA*在1583efm中的表达水平比在1505efm中稍高（1.49倍），而*rplC*的表达水平在两株菌株之间没有显著差异。这表明，RPL3的缺失可能并非直接导致利奈唑胺耐药性的主要因素，而是通过改变核糖体的微环境，间接增强*optrA*的耐药作用。结构建模分析进一步支持了这一观点，显示RPL3的缺失区域与*optrA*之间的距离超过20 ?，远超直接构象调控的典型范围，这表明RPL3的缺失可能通过改变局部电势或RNA结构，间接增强*optrA*的活性。

除了核糖体结构的变化，利奈唑胺的结合还涉及与新生肽链的相互作用，特别是与肽链末端的丙氨酸残基的相互作用。在结构建模中，我们观察到丙氨酸残基与利奈唑胺的第二个苯环之间形成了一种非典型的CH-π相互作用，这种相互作用的距离超过了常规阈值（≤3.5 ?）。此外，丙氨酸的甲基基团与利奈唑胺的第一个吗啉环之间存在空间冲突，这可能影响核糖体的转位过程。虽然这些相互作用可能不是利奈唑胺耐药性的主要驱动因素，但它们可能与核糖体结构变化共同作用，导致细菌对利奈唑胺的耐药性增强。

本研究还发现，1583efm菌株在实验室条件下对利奈唑胺的耐药性显著增强，但对其他抗生素（如红霉素、四环素和高水平链霉素）变得敏感。这可能是由于质粒编码的耐药基因的丢失，以及RPL3缺失对核糖体结构的改变。这种现象可能反映了细菌在面对利奈唑胺压力时的一种适应策略，即通过放弃对其他抗生素的耐药性来增强对利奈胺的耐药性。这种“旁效应敏感性”（collateral sensitivity）现象在其他耐药菌株中也有报道，表明细菌在进化过程中可能通过选择性地保留或丢失某些耐药基因来适应环境压力。

总的来说，本研究揭示了在宿主环境中，临床分离的粪肠球菌中出现的一种新的利奈唑胺耐药机制，即RPL3的缺失。这一机制不仅为理解利奈唑胺耐药性的多样性提供了新的视角，也为临床合理使用抗生素提供了理论依据。未来的研究可以进一步探讨这种机制在其他肠球菌菌株中的普遍性，以及其在耐药性传播中的潜在作用。此外，还需进一步研究RPL3缺失对细菌其他生理功能的影响，以及其在不同抗生素耐药性之间的相互作用。