鉴定出一种对提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工业发酵菌株乙醇耐受性至关重要的INO2等位基因

《mSystems》：Identification of a crucial INO2 allele for enhancing ethanol resistance in an industrial fermentation strain of Saccharomyces cerevisiae

本研究通过转录组分析揭示酿酒酵母AJ4、MY3、MY26三菌株乙醇耐受性差异机制，发现AJ4携带的INO2基因V263I和H86R双突变显著增强膜脂合成调控，经CRISPR-Cas9回复突变后乙醇耐受性下降，证实该基因突变通过调节 ergosterol biosynthesis及磷脂代谢相关基因影响乙醇耐受。

　　在发酵过程中，酵母细胞会经历多种相互关联的应激反应，包括渗透压、氧化、热、乙醇和营养匮乏等。这些应激条件对酵母群体的生长和发酵效率有显著影响。酵母细胞已经进化出强大的生存能力，能够应对这些突如其来的恶劣环境变化。环境应激反应（ESR）在酵母中表现为数百个基因的转录重编程。关键的转录因子如MSN2/4、HSF1和YAP1协调这一反应，它们通过激活多种保护机制，如热休克蛋白的积累、细胞周期的调节、膜甾醇的修饰和海藻糖的合成，来稳定蛋白质和细胞膜结构。这一研究发现，乙醇毒性是发酵过程中最主要的应激因素，对微生物生长、细胞周期调控和代谢活性产生直接的负面影响，从而影响生产效率和产量。因此，增强酵母细胞对乙醇的耐受能力对于提高发酵效率和代谢性能至关重要。

为了更深入地理解乙醇耐受性的分子机制，研究团队选择分析三种具有不同乙醇耐受性的酵母菌株，这些菌株之前的研究已经表明它们的膜组成存在差异。通过转录组学分析，研究人员发现这些耐受性差异与膜脂质合成基因的表达变化密切相关，尤其是与麦角甾醇生物合成相关的基因。这些基因的表达差异在乙醇耐受性菌株中尤为明显，尤其是携带INO2基因变异体的菌株。该变异体包括在Ino2p转录因子中第263位的缬氨酸到异亮氨酸替换（V263I）以及第86位的组氨酸到精氨酸替换（H86R）。这些变异体在乙醇耐受性菌株中是特异性的。通过CRISPR-Cas9技术将变异体的INO2基因重新转化为野生型序列后，发现菌株AJ4的乙醇耐受性显著降低，这表明Ino2p在调节脂质合成和膜组成方面发挥着至关重要的作用。

进一步的分析显示，Ino2p不仅调控与膜脂质合成相关的基因，还影响其他代谢通路。例如，在6%和10%乙醇条件下，许多编码麦角甾醇合成酶的基因在敏感菌株MY26和MY3中被抑制，但在耐受菌株AJ4中则保持较高的表达水平。这表明，AJ4菌株通过维持较高的麦角甾醇合成基因表达，能够更好地调节膜结构，从而增强对乙醇的耐受能力。此外，HNM1和EKI1等基因在乙醇存在的情况下表现出不同的表达模式，其中AJ4菌株的表达水平高于其他菌株，这可能与膜脂质合成的调控有关。

研究还发现，Ino2p的变异体可能通过改变其与Ino4p的相互作用来影响乙醇耐受性。Ino2p的结构分析显示，H86R变异体位于Ino2p的N端螺旋区域，可能影响其与TFIIA亚基Toa1p的结合能力。而V263I变异体则位于Ino2p与Ino4p相互作用的区域，可能通过改变蛋白结构和稳定性来影响其功能。通过构建Ino2p的突变体，研究人员发现这些变异体的缺失导致菌株的乙醇耐受性显著下降，特别是双突变体，其耐受性甚至低于中等和低耐受菌株MY3和MY26。这表明，Ino2p的变异体在菌株的耐受性中起着关键作用，它们通过调控脂质合成相关基因的表达，影响膜的物理性质，从而增强对乙醇的耐受能力。

研究还揭示了不同菌株在乙醇应激下的转录组变化。通过比较不同菌株在不同时间点和乙醇浓度下的基因表达差异，发现菌株之间的差异主要体现在膜脂质合成相关基因的表达上。例如，在无乙醇条件下，所有菌株的基因表达水平相似，但在乙醇存在的情况下，AJ4菌株的某些基因如HNM1和EKI1表现出更高的表达水平，而MY26和MY3菌株则表现出不同的表达模式。此外，通过qPCR分析，研究人员发现Ino2p的变异体显著影响了ELO1、HNM1、EKI1以及麦角甾醇合成相关基因的表达水平，从而改变了菌株的应激反应能力。

研究还探讨了菌株特异性基因表达模式对乙醇耐受性的影响。例如，MY3菌株在乙醇应激下表现出对线粒体翻译和核糖体生物合成相关基因的上调，这可能与其在乙醇环境下的代谢适应有关。而MY26菌株则表现出对蛋白质折叠和应激反应相关基因的上调，这可能帮助其应对乙醇诱导的蛋白质变性。相比之下，AJ4菌株的应激反应更倾向于通过调节膜脂质合成基因来增强其耐受性，这表明不同的菌株可能通过不同的机制来应对乙醇应激。

这些发现不仅深化了我们对酵母应激反应机制的理解，也为工业发酵中的菌株改良提供了新的思路。通过调控Ino2p的表达或其编码的变异体，可以有效提高酵母菌株的乙醇耐受性，从而优化生物技术及饮料工业中的发酵过程。此外，研究还强调了在基因工程中考虑菌株特异性遗传背景的重要性，因为不同的遗传背景可能会显著影响特定基因变异对耐受性表型的影响。未来的研究可以进一步探索这些变异体如何影响其他代谢通路，并评估其在实际工业应用中的潜力。