融合策略实现真菌漆酶在毕赤酵母中的高效表达及其对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的高效解毒作用

《Applied Food Research》：Fusion Strategy Enables High-level Expression of Fungal Laccase in Pichia pastoris for Efficient Detoxification of Aflatoxin B 1 and Zearalenone

本研究针对消费者对天然、健康、无添加剂功能饮料日益增长的需求，开发了一种以碎藏红花丝、蜂蜜和柠檬为原料的无防腐剂功能饮料。研究人员系统评估了两种包装条件（无二次包装P1和有瓦楞纸板二次包装P2）下饮料在六个月储存期内理化、生物活性、微生物及感官特性的变化。结果表明，P2包装能更有效地保留饮料的色泽、总酚含量、藏花素浓度及抗氧化能力，感官接受度更高，且产品在整个储存期内微生物稳定。该研究为开发清洁标签、高附加值的藏红花基功能饮料提供了科学依据，具有重要的应用价值。

　　

在当今追求健康生活的潮流中，消费者对食品和饮料的期望已不再局限于满足口腹之欲，而是更加青睐那些具有保健功能、成分天然且不含人工添加剂的產品。然而，开发这类“清洁标签”（Clean Label）功能饮料面临着一系列挑战，尤其是如何在长时间的储存过程中保持其营养价值、感官品质和微生物安全性。藏红花，这种源自番红花（Crocus sativus L.）干燥柱头的珍贵香料，因其独特的色泽、风味以及丰富的生物活性成分（如藏花素、苦藏花素和藏花醛）而备受瞩目。这些成分赋予了藏红花抗氧化、抗炎、神经保护等多种健康益处。在藏红花的加工过程中，会产生大量的碎丝，这些碎丝通常被作为副产品处理，但其生物活性成分含量依然丰富，为开发高性价比的功能食品饮料提供了宝贵的原料。

为了响应市场需求并充分利用资源，由Shubli Bashir领衔的研究团队开展了一项创新性研究，旨在开发一款以碎藏红花丝为主要原料，辅以天然甜味剂蜂蜜和天然防腐剂柠檬，且完全不添加任何合成防腐剂的功能性饮料。他们的研究成果发表在《Applied Food Research》上，系统地探讨了不同包装条件对这款饮料在六个月储存期内各项品质指标的影响。

为了完成这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们按照预设配方（涉及不同浓度的碎藏红花丝）制备饮料，并采用热灌装和巴氏杀菌（90°C, 25分钟）工艺确保初始微生物安全。其次，他们将饮料分装至玻璃瓶中，并设置两种储存条件：无二次包装（P1）和使用瓦楞纸板作为二次包装（P2），均在环境温度（25-30°C）下储存六个月，并在0、3、6个月时取样分析。在分析检测方面，研究团队采用了pH计和滴定法测定酸碱度，手持折光仪测定总可溶性固形物（TSS），水活度仪测定水活度（a_w），以及Lane-Eynon法测定总糖和还原糖。饮料的色泽特征使用Hunter Lab色度计在CIELAB色彩空间中进行测量，并计算色调角、彩度和总色差（ΔE）。生物活性成分的评估包括：福林酚法测定总酚含量（TP），DPPH自由基清除实验和ABTS⁺自由基阳离子清除实验评估抗氧化能力，以及高效液相色谱法（HPLC）定量分析藏花素、苦藏花素和藏花醛的含量。微生物安全性通过平板计数法检测菌落总数（PCA培养基）和酵母霉菌数（PDA培养基）来监控。最后，感官评价由经过培训的评审小组采用9点享乐标度法对产品的整体接受度进行评定。所有数据均采用双因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验进行统计学处理。

3.1. 储存期间饮料pH值、可滴定酸度和总可溶性固形物的变化

研究发现，在整个六个月的储存期间，无论饮料采用何种处理配方（T1-T4，藏红花丝含量递增）或包装条件（P1或P2），其pH值、可滴定酸度（以柠檬酸计）和总可溶性固形物（TSS）均未出现显著变化（p≥0.05）。这表明饮料的基本化学组成非常稳定，酸度没有因储存而升高，糖度也没有明显下降，为产品的储存稳定性奠定了良好基础。

3.2. 储存期间饮料水分活度的变化

水分活度（a_w）是影响食品微生物安全性和化学稳定性的关键指标。本研究结果显示，所有处理组合的饮料在P1和P2两种包装下储存六个月，其水分活度均无显著差异（p≥0.05）。这意味着饮料内部的水分状态稳定，不易引发微生物生长或某些化学反应，进一步证实了产品的储存安全性。

3.3. 储存期间饮料总糖和还原糖的变化

对总糖和还原糖的监测表明，在整个储存期内，不同处理和包装条件下的饮料其糖含量均未发生显著变化（p≥0.05）。虽然含较高藏红花丝的T4处理饮料其糖含量略高于T1处理，但差异不显著。这一结果排除了储存期间发生明显美拉德反应或发酵导致糖分降解的可能性。

3.4. 储存期间饮料色泽特征的变化

色泽是影响消费者接受度的首要因素。研究发现了显著的变化：随着储存时间延长，所有饮料的亮度（L值）显著增加，红度（a值）和黄度（b值）显著降低，表明饮料的颜色逐渐变浅、变淡。色调角增大表明颜色偏向黄色调，彩度值下降表明颜色饱和度（鲜艳度）降低，总色差（ΔE）的变化也证实了肉眼可察觉的颜色劣化。值得注意的是，藏红花丝含量最高的T4处理饮料，其初始颜色最深（a和b^*值最高），且在储存期间颜色保留最好。更重要的是，与无二次包装的P1条件相比，采用瓦楞纸板二次包装的P2条件能显著减缓这些颜色参数的劣变速度。这表明二次包装通过有效阻隔光线（尤其是紫外线），减轻了对藏红花中主要色素（如藏花素）的光氧化降解，更好地保持了产品的视觉吸引力。

3.5. 储存期间总酚类和抗氧化能力的变化

饮料的健康功效很大程度上取决于其生物活性物质的保留情况。研究发现，总酚含量（TP）以及DPPH和ABTS⁺自由基清除能力在六个月的储存期内均呈现显著下降趋势。这种降解主要归因于氧化过程和可能的光氧化作用。与颜色变化规律类似，藏红花丝含量高的T4处理其初始总酚含量和抗氧化能力最高，且在储存期间降解幅度相对较小。尤为重要的是，P2包装条件下的饮料，其总酚和抗氧化指标的保留率显著高于P1条件下的饮料。这再次凸显了二次包装在保护对光、氧敏感的生物活性成分方面的优越性。

3.6. 储存期间生物活性成分（藏花素、苦藏花素和藏花醛）的变化

通过HPLC精确测定发现，饮料中最主要的生物活性成分之一——藏花素，在储存过程中发生了显著的降解。例如，在P1包装的T1处理饮料中，藏花素在6个月时几乎完全降解，而在T4处理中也有大幅下降。相比之下，P2包装下的藏花素保留率明显更高。这种降解与藏花素分子中的共轭双键易受氧化攻击，以及饮料的酸性环境可能催化其糖苷键水解有关。相比之下，苦藏花素和藏花醛的含量在整个储存期间变化不显著。

3.7. 储存期间饮料的微生物变化

微生物安全性是即饮饮料的重中之重。令人欣慰的是，在整个六个月的储存期内，所有处理组合和包装条件下的饮料，其菌落总数和酵母霉菌数均未检出。这表明初始的巴氏杀菌工艺有效，并且饮料配方中蜂蜜和柠檬的天然抗菌特性，结合较低的pH值，共同营造了一个不利于微生物生长的环境，确保了产品在整个货架期内的微生物安全。

3.8. 储存期间饮料的感官评价

感官评价结果与上述理化指标的变化高度吻合。储存初期，藏红花丝含量高的T4处理饮料感官接受度最高。随着储存时间延长，所有饮料的感官评分均逐渐下降，但P2包装下的样品评分始终高于P1包装下的样品。感官品质的下降与藏花素（影响颜色）、苦藏花素（影响苦味）和藏花醛（影响香气）等关键风味物质的降解，以及颜色的劣变直接相关。P2包装通过更好地保护这些物质，从而延缓了感官品质的衰变。

综上所述，本研究成功开发出一款以碎藏红花丝、蜂蜜和柠檬为原料的无添加防腐剂功能饮料。核心结论表明，使用更高浓度的碎藏红花丝（如T4处理，50 mg/200 mL）并结合二次包装（P2）进行储存，能最有效地在六个月的货架期内保持饮料优异的色泽、抗氧化活性、关键生物活性成分（如藏花素）含量以及感官接受度。同时，得益于蜂蜜和柠檬的天然抗菌特性及恰当的加工工艺，饮料在整个储存期内保持了高度的微生物安全性。这项研究不仅为开发高附加值、清洁标签的藏红花基功能饮料提供了可行的配方和工艺方案，更重要的是，它明确指出了优化包装策略（如采用遮光性好的二次包装）对于最大限度保留功能性饮料健康价值和感官品质的关键作用，对相关产业具有重要的指导意义。