应用临床研究标准开展多中心确证性临床前研究：BRD4与CDK9抑制剂在PAX3::FOXO1阳性横纹肌肉瘤中的协同作用评估

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Inhibition of AKT or mTOR molecules mitigates obesity-associated metabolic disorders in Riz1-/- mice with obesity

本研究针对儿科肿瘤基础研究向临床转化成功率低的问题，建立了一个应用早期临床试验质量标准的多中心、随机、双盲临床前研究平台，并以PAX3::FOXO1(P3F)阳性横纹肌肉瘤为模型评估BRD4抑制剂JQ1与CDK9抑制剂CDKI73的协同抗肿瘤效应。结果显示JQ1单药在体外有效抑制P3F+ RMS细胞增殖并下调P3F、MYCN等靶基因表达，但未证实两药协同作用。该研究为罕见病药物开发提供了可减少偏倚的稳健临床前评估框架。

　　

在儿童癌症治疗领域，横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma, RMS)是一种罕见的软组织肉瘤，其中携带PAX3::FOXO1（简称P3F）融合基因的亚型尤为棘手。这类肿瘤好发于儿童、青少年和年轻成人，晚期患者目前几乎无法治愈，生存率极低。尽管基础科学研究不断发现新的潜在治疗靶点，但将这些发现转化为临床有效疗法的道路却充满坎坷。许多在实验室中看似前景广阔的候选药物，在后续开发阶段纷纷折戟，这凸显了获取更稳健、可重复的临床前数据的迫切性。

学术界的假设驱动型研究通常能识别出可能具有疾病特异性效应的干预措施，但高昂的失败率常归因于样本量不足、治疗分组不当、质量控制措施缺乏以及阴性结果报告不全等问题。巨大的发表压力进一步加剧了研究偏倚。对于像P3F阳性RMS这样的罕见儿科癌症，制药公司投资早期临床试验的动力往往受经济考量限制。因此，建立一套严谨、可靠且能最大程度减少偏倚的临床前研究体系，对于加速罕见病新药开发、避免患者参与无效试验、节约研发资源至关重要。

在此背景下，一个由慕尼黑工业大学等机构研究人员组成的团队进行了一项开创性的研究，旨在探索在学术环境中，应用早期临床试验的严格质量标准来规划和执行多中心确证性临床前研究的可行性。他们以难治性P3F阳性RMS为模型，重点评估了两种靶向药物——BET溴结构域蛋白4（BRD4）抑制剂JQ1和细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）抑制剂CDKI73——的协同抗肿瘤作用。其假设在于，P3F融合癌蛋白与关键转录因子（如MYOG、MYOD、MYCN）协作，通过超级增强子建立自动调节环路，维持其致癌转录程序，而BRD4对于P3F在超级增强子的活性至关重要，CDK9作为阳性转录延伸因子（p-TEFb）的催化亚基可被BRD4招募，因此抑制两者可能产生协同效应，中断致癌转录环路。这项研究的意义不仅在于检验一个具体的科学假设，更在于为学术界的临床前研究建立一个新的、更高质量的标准范式。相关研究成果发表在《Biomedicine》期刊上。

为了回答上述问题，研究人员建立了一套严格的研究体系。关键方法包括：1） 研究设计与管理：制定了符合早期临床试验质量标准的临床前研究方案，并在实验开始前进行注册，设立研究协调员监督多中心（五个体外实验中心，两个体内实验中心）试验执行，并规范不良事件报告。2） 随机化与盲法：使用计算机生成列表对四种处理（JQ1、CDKI73、联合用药、溶剂对照）进行随机分配，动物实验按研究中心和性别分层随机，所有实验由不知分组的技术人员执行终点评估。3） 实验模型：使用了7种低传代P3F阳性RMS细胞系（源自患者肿瘤或患者来源异种移植(PDX)模型）进行体外二维（2D）单层细胞培养、三维（3D）类器官培养以及小鼠皮下移植瘤生长实验；并使用小鼠来源的U23674 RMS细胞进行肌肉内移植瘤发生率实验。4） 效应评估：主要终点包括细胞增殖（WST-1法）、细胞凋亡（Annexin V/7AAD染色）、类器官活力（CellTiter-Glo? 3D）、小鼠体内肿瘤生长和发生率，并通过Western blot和qPCR检测P3F、MYCN、MYOD1、MYOG等靶基因的表达变化以验证药物靶点活性。5） 统计分析：采用线性混合效应回归模型和Cox回归模型等统计方法，主要关注JQ1与CDKI73的交互作用（即协同效应），并进行了事后分析。

3.1. JQ1抑制单层培养的RMS细胞增殖

研究人员首先在二维单层培养的7种P3F阳性RMS细胞中评估了JQ1和CDKI73对细胞增殖的影响。结果显示，与溶剂对照组相比，JQ1单药处理能显著抑制细胞生长（平均相对减少60%），效果强于CDKI73单药（平均相对减少24%）。联合用药虽然比单药显示出更强的抑制效果，但其效应并未超过两药效应的简单相加，未达到预设的协同作用统计学标准。事后分析进一步证实了JQ1的显著抗增殖效果，并且其效果与阳性对照药物长春新碱（Vincristine）相当。这表明JQ1在体外能有效抑制P3F阳性RMS细胞的生长。

3.2. JQ1降低RMS细胞中P3F、MYCN、MYOG和MYOD1的表达

为了验证药物的靶点活性，研究人员检测了药物处理后关键癌基因和转录因子的表达变化。蛋白质水平检测显示，JQ1单药或联合CDKI73处理有降低P3F蛋白表达的趋势。更重要的是，在mRNA水平上，JQ1单药及其与CDKI73的联合用药均能显著降低P3F、MYCN、MYOG和MYOD1的转录水平，而CDKI73单药则无此效应。这一结果证实了JQ1在P3F阳性RMS细胞中发挥了预期的靶向作用，即干扰了由P3F融合癌蛋白主导的致癌转录调控网络。

3.3. JQ1对RMS细胞具有促凋亡作用

通过Annexin V/7AAD染色分析细胞凋亡和坏死情况，研究发现JQ1处理显著降低了细胞活力（平均减少40%），同时增加了早期凋亡（平均增加81%）和晚期凋亡/坏死（平均增加86%）的细胞比例。CDKI73单药的效果较弱。与增殖实验类似，联合用药并未显示出协同促凋亡效应。这说明JQ1诱导的细胞生长抑制部分是通过触发细胞凋亡实现的。

3.4. JQ1抑制RMS类器官的3D生长

在更接近体内肿瘤微环境的三维类器官模型中，JQ1同样表现出强大的生长抑制能力（平均减少70%），而CDKI73的效果不确定。联合用药再次显示出叠加效应而非协同效应。基因表达分析也重复了二维培养中的发现，即JQ1能下调P3F等靶基因的表达。这表明JQ1的抗肿瘤效应在不同类型的体外模型中具有一致性。

3.5. JQ1对人RMS异种移植瘤生长有轻微作用

将研究延伸到体内，小鼠皮下移植人源P3F阳性RMS细胞后，给予药物治疗。体内实验面临挑战，包括移植瘤成功率不一、潜伏期变异大以及药物毒性问题。尽管如此，数据分析显示JQ1治疗有使肿瘤缩小的趋势（平均减少36%），但联合用药的效果并未优于单药。值得注意的是，从移植瘤组织中提取的RNA分析未检测到P3F等靶基因表达的显著变化，提示药物在体内可能未能充分作用于肿瘤靶点，这可能与药物生物利用度、剂量不足或肿瘤微环境等因素有关。

3.6. JQ1延迟小鼠Myf6Cre, Pax3:Foxo1, p53 RMS细胞的成瘤

在另一项评估肿瘤发生率的实验中，小鼠肌肉内注射鼠源RMS细胞后给药。结果显示，JQ1单药处理显著延迟了肿瘤的形成，而CDKI73单药反而缩短了成瘤时间。两药联合未显示协同作用。该实验也受到了药物组合导致的不良事件（主要是胃肠道毒性）频发的影响。

3.7. JQ1和CDKI73对小鼠具有相关的胃肠道毒性

本研究的体内实验部分报告了相当数量的不良事件，其中大部分与药物治疗相关，尤其是两药联合使用时，胃肠道毒性最为常见。这提示了这两种抑制剂联合应用时潜在的毒副作用，与某些临床研究中观察到的类似药物毒性相呼应。

3.8. 不同RMS细胞间的药物反应差异可被评估

利用多中心获得的来自不同患者的RMS细胞数据，研究人员进行了事后分析，发现不同细胞系对长春新碱的反应存在差异，但对JQ1和CDKI73的反应相对一致。这展示了多中心临床前研究平台在评估个体化治疗反应差异方面的潜力。

综上所述，这项研究的主要结论在于，成功证明了在学术环境下应用临床 trial 标准开展多中心、随机、双盲确证性临床前研究是可行的。这套研究平台为获取更稳健的 preclinical 数据、减少研究偏倚提供了宝贵框架。在具体的科学发现上，研究证实了BRD4抑制剂JQ1在体外能有效抑制P3F阳性横纹肌肉瘤细胞的生长并诱导凋亡，其效果与标准化疗药长春新碱相当，并且通过下调P3F、MYCN等关键基因表达证实了其靶点活性。然而，研究未能证实JQ1与CDK9抑制剂CDKI73之间存在协同抗肿瘤效应。体内实验效果有限，且受到移植瘤模型变异性和药物（尤其是联合用药）毒性的挑战。

在讨论中，作者强调了确证性临床前研究对于提高基础研究向临床转化成功率的重要性，特别是对于患者数量少、商业投资动力不足的罕见病（如儿科癌症）而言。这类研究有助于筛选出最有希望的候选药物进入临床，避免患者参与无效试验，节省宝贵的研发资源。本研究建立的平台及其经验教训，为未来优化类似研究提供了重要参考，例如需要更充分的体内剂量探索、选择生物利用度更佳的化合物等。尽管最初的协同作用假设未被证实，但JQ1单药所展现出的显著抗肿瘤活性，为其在P3F阳性横纹肌肉瘤中的进一步开发提供了依据。总之，这项工作为推动更严谨、更可靠的转化医学研究树立了标杆，其意义远超对特定药物组合的评估，为罕见病治疗药物的开发开辟了更为稳健的道路。