大麻二酚变素（CBDV）直接靶向肿瘤中调节性髓系细胞的免疫抑制活性

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Cannabidivarin directly targets the immunosuppressive activity of regulatory myeloid cells in tumors

本研究针对肿瘤微环境（TME）中髓系抑制细胞（MDSCs和TAMs）导致的免疫治疗耐受难题，探讨了非精神活性大麻素Cannabidivarin（CBDV）的免疫调节潜力。研究人员通过体外、体内及人源细胞模型证实，CBDV能直接作用于髓系抑制细胞，显著降低其关键免疫抑制标志物iNOS和Arg-1的表达，并促进TAMs向M1样表型极化，从而恢复CD8+ T细胞功能，抑制肿瘤进展。该研究为克服肿瘤免疫抑制提供了新的候选药物和策略。

　　

在对抗癌症的战争中，免疫疗法被誉为革命性的突破，它旨在调动人体自身的免疫系统来攻击肿瘤细胞。然而，这场战争并非一帆风顺，尤其是在实体瘤中，治疗效果常常不尽如人意。其核心障碍在于肿瘤内部存在一个被称为肿瘤微环境（TME）的复杂“堡垒”，其中驻扎着一群名为髓系抑制细胞的“叛军”，主要包括髓系来源抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。这些细胞通过表达免疫抑制分子，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶-1（Arg-1），消耗T细胞活化所必需的氨基酸精氨酸，并分泌抑制性细胞因子，从而有效地压制了负责杀伤肿瘤的CD8⁺ T细胞的活性。因此，寻找能够直接靶向并“策反”这些髓系抑制细胞、解除肿瘤微环境免疫抑制的新策略，成为了提高癌症免疫治疗成功率的关键。

在此背景下，研究人员将目光投向了大麻植物中含量丰富但研究相对较少的非精神活性成分——大麻二酚变素（Cannabidivarin, CBDV）。此前的研究表明，CBDV是Toll样受体4（TLR4）的拮抗剂，而TLR4信号通路在MDSCs和TAMs的存活、分化及免疫抑制功能中扮演重要角色。因此，研究团队假设CBDV可能通过干预TLR4等途径，直接削弱髓系抑制细胞的免疫抑制能力。为了验证这一设想，来自以色列理工学院癌症生物学和大麻素研究实验室的Miryam Steinberg等研究人员在《Biomedicine 》上发表论文，系统探究了CBDV对小鼠和人类来源的髓系抑制细胞功能的直接影响及其抗肿瘤效果。

为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。他们建立了小鼠骨髓来源的MDSCs（BM-MDSCs）体外分化模型，并利用B16F10黑色素瘤细胞的条件培养基模拟肿瘤微环境。通过流式细胞术（Flow Cytometry）分析细胞表面标志物（如Ly6C, Ly6G, F4/80）和细胞内蛋白（iNOS, Arg-1），来鉴定髓系细胞亚群及其免疫抑制状态。荧光激活细胞分选（FACS）用于分离纯化的单核细胞性MDSCs（MO-MDSCs）和粒细胞性MDSCs（PMN-MDSCs）。实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western Blot）分别用于检测基因和蛋白水平的表达变化。T细胞抑制实验则用于评估经CBDV处理的MDSCs对CD8⁺ T细胞增殖和活化（通过检测颗粒酶B GrzB和干扰素γ IFN-γ）的影响。此外，研究还通过细胞形态学观察、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子（TNF-α, IL-10）来评估巨噬细胞的极化状态。在动物水平，研究人员构建了B16F10黑色素瘤小鼠模型，通过体内给药评估CBDV对肿瘤生长、小鼠生存期以及肿瘤内免疫细胞浸润的影响。最后，为了验证临床相关性，研究还利用了从健康捐赠者血液中分离的人外周血单核细胞（PBMCs）和中性粒细胞（PMNs），在A375人黑色素瘤细胞条件培养基存在下，考察了CBDV对人髓系细胞表型的影响。

3.1. 建立研究CBDV对髓系细胞影响的小鼠体外模型

研究人员首先建立了小鼠骨髓来源细胞的体外分化体系，并用B16F10黑色素瘤条件培养基模拟肿瘤微环境，成功诱导出表达免疫抑制标志物iNOS和Arg-1的MDSCs。他们发现，脂多糖（LPS）可进一步增强iNOS和Arg-1的表达，而CBDV处理则能浓度依赖性地抑制这种诱导表达，特别是在MO-MDSCs中效果更为显著。通过剂量筛选，确定了4 μg/ml的合成CBDV和等效大麻素含量的5 μg/ml高CBDV提取物为后续实验的非细胞毒性有效浓度。

3.2. CBDV降低MO-MDSCs中iNOS和Arg-1的表达

流式细胞术、qPCR和Western Blot结果一致表明，无论是高CBDV提取物还是纯化的合成CBDV，均能显著降低MO-MDSCs中iNOS和Arg-1在mRNA和蛋白水平的表达。然而，对于PMN-MDSCs，CBDV对Arg-1的抑制作用不明显，且该亚群本身Arg-1的基础表达水平就较低。

3.3. 经CBDV处理的MO-MDSCs丧失抑制CD8⁺ T细胞的能力

功能实验证实，未经处理的MO-MDSCs能强烈抑制CD8⁺ T细胞的增殖，并降低其细胞毒性效应分子GrzB和促炎细胞因子IFN-γ的表达。而经CBDV预处理后的MO-MDSCs，其免疫抑制能力被显著削弱，CD8⁺ T细胞的增殖能力和效应功能得到恢复。PMN-MDSCs在本实验体系中本身对T细胞的抑制能力较弱，CBDV处理也未显示出显著影响。

3.4. CBDV促使巨噬细胞极化为M1样表型

当允许MDSCs进一步分化为巨噬细胞时，CBDV处理诱导了巨噬细胞形态向更伸长的M1样特征转变。流式细胞术分析显示，CBDV增加了M1型标志物（CD86, iNOS）的表达，降低了M2型标志物（CD206, Arg-1）的表达。Western Blot进一步证实了iNOS蛋白的上调和Arg-1蛋白的下调。ELISA结果显示，CBDV处理降低了巨噬细胞分泌M2相关细胞因子IL-10，并增加了M1相关细胞因子TNF-α的分泌趋势，表明CBDV促进了巨噬细胞向抗肿瘤的M1样表型极化。

3.5. CBDV治疗减缓B16F10肿瘤进展并塑造免疫抑制性较低的TME

在B16F10黑色素瘤小鼠模型中，腹腔注射CBDV（1 mg/kg）显著抑制了肿瘤生长，降低了肿瘤重量，并延长了荷瘤小鼠的生存期。对肿瘤组织内免疫细胞的分析发现，CBDV治疗组肿瘤内的MO-MDSCs和PMN-MDSCs的iNOS表达均显著降低，MO-MDSCs和TAMs的Arg-1表达也明显下降。同时，肿瘤内CD8⁺ T细胞的数量有增加趋势，且其表达的GrzB水平显著升高，表明T细胞的杀伤功能得到增强。

3.6. CBDV降低人髓系细胞的免疫抑制特性

在人类细胞模型中，CBDV处理逆转了由人黑色素瘤细胞条件培养基诱导的人单核细胞CD14表达的上调，而CD14高表达与免疫抑制和不良预后相关。对于从血液中分离的中性粒细胞，CBDV增强了其成熟标志CD11b的表达，并降低了免疫抑制相关标志CD14的表达。这些结果表明，CBDV同样能够调节人髓系细胞的表型，使其趋向更成熟、免疫抑制性更低的状态。

综上所述，本研究通过多层次、多物种的实验证据，清晰地表明CBDV能够直接靶向肿瘤微环境中的髓系抑制细胞。其核心作用机制在于下调关键免疫抑制酶iNOS和Arg-1的表达（尤其在MO-MDSCs中），并促使巨噬细胞向抗肿瘤的M1样表型转化，从而解除对CD8⁺ T细胞的抑制，增强抗肿瘤免疫应答。在讨论部分，作者指出，尽管本研究揭示了CBDV的功能性效果，其精确的分子作用靶点和下游信号通路（除TLR4拮抗的提示外）仍有待进一步阐明。此外，研究主要聚焦于黑色素瘤模型，未来需要在更多癌种中验证CBDV的普适性。值得注意的是，纯化的CBDV分子在多数实验中显示出比全谱系高CBDV提取物更强的效果，这提示其作用可能主要源于CBDV本身。然而，考虑到许多癌症患者已在临床中使用大麻提取物进行姑息治疗，使用高CBDV提取物或许能同时提供抗肿瘤和缓解症状的双重益处。

这项研究的意义重大，它首次揭示了CBDV作为一种非精神活性大麻素，在重编程肿瘤免疫微环境方面的直接作用，为开发新一代靶向髓系细胞的免疫治疗辅助药物提供了强有力的候选分子，有望为克服当前肿瘤免疫治疗的瓶颈开辟新的途径。