转基因小鼠模型揭示网织血小板在心肌缺血/再灌注后的扩增及其功能作用

《Blood Vessels, Thrombosis & Hemostasis》：A Transgenic Mouse Model for Reticulated Platelet Detection Reveals Expansion After Myocardial Ischemia/Reperfusion

本研究针对网织血小板(RP)在心肌缺血/再灌注(I/R)损伤后功能不清的问题，开发了Pf4-Cre:RiboTag转基因小鼠模型，通过HA标签流式细胞术发现RP在I/R后扩增且呈现高反应性，转录组学提示其通过配体-受体相互作用调控心脏炎症与修复，为靶向血小板治疗心血管疾病提供了新见解。

　　

当心脏的血液供应突然中断（心肌缺血）后又恢复（再灌注）时，会引发一系列复杂的病理过程，其中血小板的活化扮演着关键角色。在众多的血小板亚群中，有一类被称为网织血小板（Reticulated Platelets, RP）的特殊群体引起了科学家的注意。它们是新从骨髓巨核细胞释放入血的、富含核糖核酸（RNA）的年轻血小板，以其高度的反应性而著称。临床观察发现，经历过心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤的患者体内，循环网织血小板的数量会升高。然而，一个核心的悬而未决的问题是：这些网织血小板仅仅是血小板更新加速的一个被动生物标志物，还是它们会主动参与到心脏损伤后的炎症反应和组织修复过程中，从而影响疾病的进程？由于缺乏能够在不依赖核酸染料的情况下特异性识别和分离网织血小板的理想动物模型，这个问题一直难以深入探究。

为了回答这一关键问题，由Muataz Ali Hamad、Thomas G. Nührenberg和Daniel Duerschmied等领导的研究团队在《Blood Vessels, Thrombosis》上发表了一项创新性研究。他们成功地构建了一种名为Pf4-Cre:RiboTag的转基因小鼠模型，该模型能够特异性地在血小板及其前体巨核细胞中表达血凝素（Hemagglutinin, HA）标签标记的核糖体蛋白。这一巧妙的遗传学设计使得研究人员能够利用针对HA标签的流式细胞术（Flow Cytometry）来高特异性地区分和分离网织血小板，而无需使用传统的核酸染料（如噻唑橙），避免了染料可能带来的非特异性和功能干扰。利用这一强大工具，研究团队深入探索了在心肌I/R损伤后，网织血小板的动态变化、功能特性及其潜在的分子机制。

研究人员为开展本研究主要应用了几个关键技术：首先是构建了Pf4-Cre:RiboTag转基因小鼠模型，实现了对巨核细胞/血小板谱系核糖体的特异性标记；其次是利用基于HA标签的流式细胞术进行网织血小板的鉴定和分选；第三是对分选出的血小板群体进行了体外功能评估，包括表面标志物表达和激动剂反应性检测；第四是应用批量RNA测序（Bulk RNA Sequencing）技术，对比分析了I/R损伤后网织与非网织血小板的转录组差异。

HA标签流式细胞术检测到心肌I/R后循环网织血小板增加

研究首先验证了模型的可靠性。他们证实，在Pf4-Cre:RiboTag小鼠中，HA标签确实特异性地在血小板中表达。通过基于HA的流式细胞术分析，他们发现，与假手术组相比，经历心肌I/R损伤的小鼠在术后48小时，循环血液中网织血小板的比例显著升高。这一发现与使用传统核酸染料噻唑橙（Thiazole Orange）所得到的结果一致，从而确认了HA标签检测方法的有效性，并揭示了心肌I/R损伤会诱发体内网织血小板的扩增。

网织血小板表现出高反应性表型

为了了解这些扩增的网织血小板有何特殊之处，研究人员对分选出的血小板进行了体外功能分析。结果发现，网织血小板在静息状态下就表现出更高的糖蛋白Ibα（Glycoprotein Ibα, GPIbα）基础表达水平，GPIbα是血小板初始粘附于受损血管壁的关键受体。更重要的是，当用激动剂（如凝血酶受体激活肽）刺激时，网织血小板表面激活形式的糖蛋白IIb/IIIa（Glycoprotein IIb/IIIa, GPIIb/IIIa）以及P-选择素（P-selectin）的表达增加幅度更为显著。P-选择素是血小板α颗粒膜蛋白，其表达上调标志着血小板颗粒的释放和活化状态的增强。这些数据共同表明，心肌I/R后出现的网织血小板不仅数量增多，而且其本身具有高度的活化潜能，是一种超反应性（Hyperreactive）的血小板亚群。

网织和非网织血小板的转录组分析揭示了与血小板活化、细胞骨架组织和伤口愈合相关的富集通路

研究深入到分子层面。研究人员对I/R损伤48小时后分选出的网织血小板和非网织血小板进行了批量RNA测序。转录组学分析揭示，两者之间存在显著的基因表达差异。网织血小板的转录组特征显示出与“血小板活化”、“细胞骨架重组”以及“伤口愈合”等生物学通路相关的基因显著富集。这表明网织血小板在转录水平上就预设了更强的功能活性，准备好在损伤部位迅速响应并参与后续过程。

配体-受体分析预测网织血小板与心脏内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的相互作用

为了探究网织血小板如何可能影响心脏 microenvironment（微环境），研究人员进行了配体-受体（Ligand–Receptor）相互作用分析。他们基于测序数据，预测了网织血小板表面可能高表达的配体或受体，并发现这些分子有可能与心脏中的主要细胞类型——包括内皮细胞（Endothelial Cells）、成纤维细胞（Fibroblasts）和巨噬细胞（Macrophages）——发生通讯。例如，血小板可能通过释放某些因子或通过表面分子直接接触，调节内皮细胞的炎症反应、成纤维细胞的增殖分化（影响纤维化修复）或巨噬细胞的极化状态。这为网织血小板主动调控心脏I/R后炎症和组织重塑（Tissue Remodeling）提供了潜在的分子机制假说。

综上所述，这项研究通过创新的Pf4-Cre:RiboTag转基因小鼠模型，有力地证明了网织血小板并非心肌缺血/再灌注损伤后无关紧要的旁观者。它们是一个在转录水平和功能上都与众不同的、高反应性的血小板亚群，在损伤后数量显著扩增。这些血小板具有增强的活化能力，并且其独特的基因表达谱暗示它们可能通过与其他心脏细胞的相互作用，积极参与到损伤后的炎症反应和组织修复/重塑过程中。这项研究不仅为理解血小板异质性在心血管疾病中的作用提供了新的重要视角，而且所建立的遗传学模型为未来进一步剖析网织血小板的具体功能机制及其作为治疗靶点的潜力提供了一个强大而可靠的平台。最终，这些发现可能启发新的治疗策略，通过特异性调控网织血小板或它们介导的信号通路，来减轻心肌I/R损伤的不良后果，改善患者预后。