CHO-K1细胞表达CD47单抗中Fd+16 Da片段杂质的溯源鉴定与特性研究

《Current Pharmaceutical Analysis》：Identification and characterization of the Fd+16 Da fragment impurity in therapeutic CD47 monoclonal antibodies expressed in CHO-K1 cell lines

本刊推荐：研究人员针对CHO-K1细胞表达的CD47单抗中出现的Fd+16 Da杂质开展系统性溯源分析，通过肽图映射、氧化稳定性测试等技术，明确该杂质源于CDR3区色氨酸氧化，并证实其在不同降解条件下的稳定性，为抗体药物的工艺开发与质量控制提供了关键数据支撑。

　　

在生物制药领域，单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）因其高特异性和疗效已成为肿瘤治疗的重要武器。然而，抗体药物的生产过程复杂，其中宿主细胞的选择、培养条件及后续纯化工艺均可能引入各类杂质，直接影响药物的安全性与有效性。CD47作为一种新兴的免疫检查点靶点，其抗体药物可通过阻断“别吃我”信号（即CD47与信号调节蛋白α（SIRPα）的相互作用），激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，展现出广阔的临床应用前景。

本研究聚焦于一款在CHO-K1（Chinese hamster ovary-K1）细胞中稳定表达的CD47单抗（WBP2131）。研究人员在质量分析中发现，相较于早期使用HEK293（human embryonic kidney 293）细胞瞬时表达的产品，CHO-K1细胞表达的抗体中出现了一个分子量增加16 Da的新杂质（命名为Fd+16 Da）。这一微小质量差异提示可能存在氧化等翻译后修饰（post-translational modification, PTM），但其具体来源、性质及对药物功能的影响尚不明确。为此，研究团队展开了一系列精细的鉴定工作，以追溯该杂质的成因并评估其稳定性，相关成果发表于《Current Pharmaceutical Analysis》。

为精准解析Fd+16 Da杂质，研究人员主要采用了以下关键技术：

1. 1.
   酶切-液相色谱-质谱联用分析：使用IdeS酶对抗体进行特异性酶切，结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）与高分辨率质谱（如Quadrupole-Orbitrap MS），分离并鉴定抗体片段（如Fc/2、轻链（light chain, LC）及Fd片段）及其修饰产物。
2. 2.
   肽图映射（peptide mapping）：通过胰蛋白酶或Lys-C酶对抗体进行酶解，利用C18色谱柱进行肽段分离，并通过质谱检测获得肽段序列及修饰信息，实现氧化位点的精确定位。
3. 3.
   降解与氧化稳定性测试：对抗体样品进行高温（40°C、56°C）加速降解及过氧化氢（H₂O₂）氧化处理，比较杂质含量变化，评估其在不同应力条件下的稳定性。
4. 4.
   去糖基化分析：使用PNGase F去除抗体糖链，排除糖基化修饰对分子量影响的干扰，确认质量偏移源于氨基酸残基氧化。

3.1. 杂质分析

通过对三批CHO-K1细胞表达的CD47单抗（WBP2131-B9Z4-04-T4、WBP2131-B9Z4-08-T4、WBP2131-STD）进行IdeS酶切及LC-MS分析，均检测到Fd+16 Da杂质，含量在5.9%至9.1%之间，表明该杂质的形成具有批次一致性，非偶然现象。

3.2. HEK293细胞中杂质的验证

为探究宿主细胞来源的影响，研究人员将同一质粒重新转染至HEK293细胞，发现其表达的抗体（WBP2131-293）中也存在Fd+16 Da杂质，而早期HEK293细胞表达的抗体（WBP2131-CLI）则无此杂质。这一矛盾结果提示杂质形成可能与特定细胞培养状态或代谢环境相关，需进一步探究。

3.3. 去糖基化后杂质分析

对CHO-K1细胞表达的抗体进行去糖基化、还原及烷基化处理后，LC-MS分析显示在重链（heavy chain, HC）左侧出现较HC分子量高16 Da的异常峰，且含量与Fd+16 Da杂质相当，证明该质量偏移并非源于糖链氧化，而是重链氨基酸残基的修饰。

3.4. 肽图映射分析确定杂质来源与位点

通过两轮肽图映射分析，第一轮使用C8柱未发现显著差异；第二轮采用更高分辨率的C18柱与Thermo QE质谱仪，发现WBP2131-STD中互补决定区3（complementarity-determining region 3, CDR3）的TWWR肽段氧化率（5.7%）显著高于WBP2131-CLI（0.7%）。质谱碎片分析进一步将氧化位点锁定于该肽段第二个色氨酸（tryptophan, W）残基，确证Fd+16 Da杂质由色氨酸氧化形成。研究推测，CHO-K1细胞线粒体氧化代谢产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平较高，可能促进了CDR3区色氨酸的氧化，而该区域结构柔性更易暴露于氧化环境。

3.5. 高温测试

抗体样品在40°C下放置4周或56°C下处理3天后，TWWR肽段的氧化率未发生显著变化（约8% vs 7%），表明该氧化修饰在高温条件下相对稳定，抗体对温度波动具有一定耐受性。

3.6. 氧化条件对杂质的影响

通过H₂O₂氧化处理并结合不同前处理方式（如酶切-还原-变性、去糖基化-还原等），发现Fd+16 Da杂质含量均未发生明显改变，进一步证实该杂质对H₂O₂氧化不敏感，且其形成与糖链无关。此外，变性处理会改变杂质疏水性，影响其在色谱中的保留行为。

本研究通过多维度分子表征技术，成功溯源CD47单抗WBP2131中Fd+16 Da杂质的成因，明确其为CDR3区色氨酸（第二位W）氧化所致，并系统评估了该杂质在高温、氧化应力下的稳定性。初步功能实验显示，该氧化修饰未显著影响抗体与CD47的亲和力（K_D值约10^-8 M级）及体外促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，提示其可能对药物安全性、有效性影响有限。然而，杂质形成的深层机制（如细胞代谢差异）仍需进一步探索。该研究为CD47单抗的工艺优化、质控策略制定及存储运输条件提供了关键数据支撑，也为其他抗体药物的杂质研究与分子设计提供了重要参考。