低剂量脱氧雪腐镰刀菌烯醇与铜联合暴露通过线粒体活性氧介导的细胞死亡通路协同增强肠道毒性

《Environmental Advances》：Low dosage exposure of deoxynivalenol and copper synergistically enhanced the intestinal toxicity

本研究针对饲料及谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与铜(Cu)共存污染问题，通过IPEC-J2细胞和小鼠肠道类器官模型，首次揭示低剂量DON+Cu联合暴露通过诱导线粒体活性氧(mtROS)积累，破坏线粒体膜电位(MMP)和线粒体通透性转换孔(mPTP)，抑制线粒体抗氧化蛋白表达，进而协同激活细胞凋亡与铁死亡的关键机制。研究为制定更科学的饲料污染物限量标准提供了重要理论依据。

　　

在当今全球粮食安全领域，霉菌毒素与重金属的复合污染问题日益凸显。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）作为一种由镰刀菌产生的B型单端孢霉烯族霉菌毒素，由于其化学稳定性和耐高温特性，在谷物和饲料中广泛存在。近年调查显示，全球约60-70%的谷物样本中检测到DON污染，而我国居民尿液样本中DON检出率高达92%。与此同时，铜（Cu）作为动物饲料中常用的生长促进剂和抗菌剂，在养殖业中存在过量添加现象，导致其在农产品中残留风险增加。更令人担忧的是，现实环境中DON与Cu往往同时存在，形成复合污染，但两者之间的相互作用及其对肠道的联合毒性效应尚未明确。

针对这一科学问题，华南农业大学兽医学院生命科学学院的钟高龙、林如青等研究人员在《Environmental Advances》上发表了创新性研究成果。该研究首次系统探讨了低剂量DON与Cu联合暴露对肠道上皮的毒性效应及其分子机制。

研究人员主要采用了猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）培养、小鼠肠道类器官模型构建、高通量转录组测序、蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时定量PCR（qRT-PCR）、免疫荧光染色、线粒体功能检测（包括线粒体膜电位MMP、线粒体通透性转换孔mPTP和线粒体超氧化物mtROS的测定）等关键技术方法。其中小鼠肠道类器官来源于6周龄C57小鼠的肠道隐窝组织。

研究结果部分显示：

3.1. DON和Cu对IPEC-J2细胞活力的影响

研究人员首先评估了不同浓度DON和Cu对IPEC-J2细胞活力的影响。结果显示，单独暴露于0.2 μM DON或25 μM Cu时，细胞活力未出现显著下降；然而，当两者联合暴露时，即使使用同样低剂量，细胞活力却出现显著抑制。通过CalcuSyn软件分析发现，联合指数（CI）小于1，证实DON与Cu之间存在协同毒性效应。形态学观察进一步显示，联合暴露组细胞出现明显皱缩和密度降低。

3.2. DON和Cu联合处理损害IPEC-J2细胞的屏障功能

紧密连接蛋白是维持肠道上皮屏障完整性的关键分子。Western blot和免疫荧光结果显示，DON+Cu联合暴露显著抑制了Claudin-1和Occludin蛋白表达，而单独暴露组则未见明显变化，表明低剂量联合暴露可破坏肠道上皮屏障完整性。

3.3. DON和Cu联合处理对IPEC-J2细胞转录组的影响

高通量转录组测序揭示了联合暴露的分子机制。主成分分析（PCA）显示对照组与DON+Cu处理组明显分离。差异表达基因分析鉴定出917个显著差异基因，KEGG富集分析表明这些基因主要富集于铁死亡、谷胱甘肽代谢、细胞周期等信号通路。尤为重要的是，铁死亡标志基因ACSL4在联合暴露组显著上调。

3.4. DON和Cu联合处理对IPEC-J2细胞程序性死亡的影响

研究人员进一步验证了多种程序性死亡方式在联合毒性中的作用。结果表明，DON+Cu联合暴露显著上调促凋亡蛋白（Bak、Bax、Caspase-9、Cleaved-Caspase-3、Cytc），下调抗凋亡蛋白Bcl-2。同时，铁死亡相关蛋白FTH1、GPX4和SLC7A11表达显著降低，而ACSL4和PTGS2则明显升高。值得注意的是，焦亡和铜死亡相关蛋白在联合暴露组未见显著变化，表明凋亡和铁死亡是主要的细胞死亡方式。

3.5. 肠道类器官验证DON和Cu联合处理的毒性效应

为更接近体内情况，研究建立了小鼠肠道类器官模型。形态学观察显示，DON+Cu联合暴露显著破坏类器官结构，降低类器官出芽效率。H&E染色显示类器官完整性破坏和上皮细胞空泡变性。免疫荧光证实Occludin表达下降，凋亡标志物Caspase-3升高而Bcl-2降低，铁死亡抑制蛋白GPX4也显著减少。

3.6. DON和Cu联合处理对IPEC-J2细胞线粒体氧化还原稳态的影响

线粒体是细胞能量代谢和氧化还原平衡的核心细胞器。研究发现，DON+Cu联合暴露显著降低线粒体抗氧化蛋白SOD2、PRDX3和TRX2的表达，同时引起mtROS积累、mPTP开放和MMP下降，表明线粒体氧化还原稳态严重失衡。

3.7. 清除mtROS减轻DON和Cu联合处理诱导的IPEC-J2细胞毒性

为确认mtROS的关键作用，研究人员使用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ进行干预。结果显示，MitoQ预处理显著缓解了DON+Cu引起的细胞活力下降、线粒体抗氧化蛋白表达抑制、mtROS积累、mPTP开放和MMP下降。更重要的是，MitoQ还逆转了凋亡和铁死亡相关蛋白的表达变化，证实mtROS积累是上游关键事件。

研究结论与讨论部分强调，低剂量DON与Cu联合暴露通过协同作用显著增强肠道毒性，其机制涉及mtROS积累导致的线粒体功能紊乱，进而激活凋亡和铁死亡信号通路。这一发现不仅揭示了环境污染物复合效应的新机制，还为制定更科学的饲料安全标准提供了重要依据。值得注意的是，虽然铜死亡是铜毒性的新型机制，但在本研究的低浓度条件下并未显著激活，提示不同剂量可能触发不同的细胞死亡途径。

该研究的创新之处在于首次系统阐明了DON与Cu协同毒性的线粒体机制，并采用肠道类器官模型验证了体外研究结果，为评估实际污染情况下的健康风险提供了更接近体内的实验证据。未来研究需要进一步开展动物实验，以验证这些发现在整体生理环境下的适用性，并探索可能的干预策略。