基于mRNA递送的CRISPR表观遗传编辑器实现体内持久高效基因沉默

《The Innovation》：mRNA-Engineered CRISPR-Cas epigenetic editors enable durable and efficient gene silencing in Vivo

本研究针对CRISPR表观遗传编辑器因分子尺寸过大导致体内递送效率低的难题，开发了基于mRNA-LNP递送的紧凑型表观遗传编辑器（CRISPR OFF-EE）。单次静脉注射即可在小鼠体内实现Pcsk9基因的长期沉默（>180天），显著降低PCSK9（~83.2%）和LDL-C（~51.4%）水平，为基于表观遗传沉默的体内治疗提供了安全高效的平台。

　　

在生物医学研究领域，能够精确调控基因表达而不改变DNA序列的技术一直被视为具有革命性的治疗潜力。CRISPR基因编辑系统的出现为这一目标带来了曙光，但其核心应用——切割DNA——存在潜在的安全风险。因此，科学家们将目光投向了表观遗传编辑（Epigenetic Editing），即通过修饰DNA或组蛋白上的化学标记（如甲基化）来“关闭”或“打开”基因，实现可逆且持久的基因表达调控。然而，将这一宏伟蓝图转化为临床现实的道路上横亘着巨大的障碍。当前基于CRISPR的表观遗传编辑器通常体积庞大，因为它们需要将CRISPR系统的DNA结合模块（如SpCas9蛋白）与巨大的表观遗传修饰酶（如DNMT3A）融合在一起。这种“大块头”特性使得它们难以被高效地包装并递送到活体（in vivo）动物的目标细胞中，严重限制了其治疗应用。

为了解决这一瓶颈问题，来自南方科技大学的研究团队在《The Innovation》上发表了一项重要研究。他们致力于开发一种更小巧、更高效的表观遗传编辑平台。研究人员理性设计并改造了多种紧凑型的CRISPR表观遗传编辑器。他们不仅使用了经典的SpCas9，还采用了内含肽分割（intein-split）的SpCas9以减小尺寸，并引入了一种更小的Cas蛋白变体——Cas-SF01（一种Cas12i3变体）。将这些编辑器与经过优化的信使RNA（mRNA）结构相结合，并利用脂质纳米粒（Lipid Nanoparticle, LNP）作为递送载体，他们成功构建了名为CRISPR OFF-EE的系统。通过单次静脉注射将编码这些编辑器的mRNA和靶向小鼠Pcsk9基因的向导RNA（guide RNA, gRNA）共同递送到小鼠体内，研究人员观察到了令人振奋的结果：血液循环中的PCSK9蛋白水平显著降低了约83.2%，与之相关的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平也相应降低了约51.4%。更关键的是，这种基因沉默效果非常持久，至少能维持180天。此外，与基于SpCas9的编辑器相比，基于Cas-SF01的编辑器表现出更高的特异性，脱靶甲基化事件更少。整个LNP递送系统也显示出良好的安全性，且主要靶向肝脏。这项研究成功地建立了一个强大而通用的平台，为利用瞬时表达的、工程化的mRNA编辑器进行精确持久的表观遗传沉默，进而推动体内治疗的发展奠定了坚实的基础。

为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：理性蛋白质工程方法，用于设计紧凑型CRISPR表观遗传编辑器（CRISPR OFF-EE），包括使用SpCas9、内含肽分割的SpCas9以及更小的Cas-SF01（Cas12i3变体）；mRNA架构优化与体外转录技术，以制备高效、稳定的编辑器编码mRNA；脂质纳米粒（LNP）配方优化与制备技术，用于实现高效的体内（in vivo）递送，该配方显示出以肝脏为主的趋向性；以及小鼠模型体内的药效学和持久性评估，通过单次静脉注射LNP-mRNA/gRNA复合物，长期监测靶基因Pcsk9沉默后PCSK9蛋白和LDL-C水平的变化。

理性设计与工程化紧凑型CRISPR表观遗传编辑器

研究人员首先着手解决编辑器尺寸过大的核心问题。他们系统地设计并构建了多种紧凑型的表观遗传编辑器。这些编辑器基于不同的DNA结合平台：包括全长SpCas9、通过内含肽分割策略减小尺寸的SpCas9，以及一个尺寸更小的新型Cas蛋白——Cas-SF01（一种Cas12i3的工程化变体）。将这些DNA结合模块与表观遗传效应结构域（如DNA甲基转移酶）融合，形成了最终的CRISPR OFF-EE系统。通过这一系列的工程化改造，他们成功获得了分子尺寸更小、更适合LNP包装和递送的表观遗传编辑工具。

优化mRNA和LNP递送平台实现高效体内基因沉默

研究的另一个关键环节是递送系统的优化。研究人员不仅优化了编辑器本身，还对其编码mRNA的结构进行了精心设计，以提高其稳定性和翻译效率。随后，他们利用优化的LNP配方将这些编辑器的mRNA与靶向小鼠Pcsk9基因的gRNA共同封装。通过单次静脉注射将LNP-mRNA/gRNA复合物递送到小鼠体内。结果表明，该递送系统能够高效地将编辑器组分递送至肝脏。一次给药后，即可在肝脏中实现Pcsk9基因的高效且持久的表观遗传沉默，导致血液循环中PCSK9水平显著且持久地下降（最高降低约83.2%），并伴随LDL-C水平的相应降低（约51.4%），效果可持续至少180天。

基于Cas-SF01的编辑器展现出更高的特异性

为了评估不同编辑器的安全性，研究人员对基于SpCas9和基于Cas-SF01的编辑器进行了脱靶效应分析。结果显示，与基于SpCas9的编辑器相比，基于Cas-SF01的编辑器在全基因组范围内引发的非目标位点DNA甲基化事件（即脱靶甲基化）显著更少。这表明尺寸更小的Cas-SF01可能具有更高的特异性，为其在治疗应用中的安全性提供了优势。

优化的LNP递送系统显示出良好的安全性和肝脏趋向性

最后，研究人员对他们的LNP递送系统进行了安全性评估。结果表明，优化后的LNP配方在小鼠体内表现出良好的耐受性，未引起显著的毒性反应。同时，该LNP系统显示出明显的肝脏趋向性，即主要将治疗性mRNA递送至肝脏组织，这对于治疗肝脏相关疾病（如通过靶向Pcsk9调节胆固醇代谢）具有重要意义。

综上所述，本研究成功地开发了一种基于mRNA-LNP递送的紧凑型CRISPR表观遗传编辑平台（CRISPR OFF-EE）。该平台通过理性工程设计减小了编辑器的尺寸，结合优化的mRNA和LNP递送技术，实现了单次给药即可在活体动物体内介导持久、高效且特异的靶基因沉默。研究证实，靶向Pcsk9能够长效降低PCSK9和LDL-C水平，为治疗心血管疾病等提供了新的潜在策略。特别值得一提的是，基于Cas-SF01的编辑器展现了优于传统SpCas9编辑器的特异性。该研究建立的平台具有鲁棒性和通用性，极大地推动了基于精确、持久表观遗传沉默的体内治疗技术的发展，为将CRISPR表观遗传编辑技术转化为临床应用奠定了坚实的基础。其重要意义在于证明了一次性、瞬时的mRNA递送即可产生长期的治疗效果，避免了持续给药的麻烦和潜在风险，为众多遗传性和获得性疾病的治疗开辟了新的途径。