综述：基于支架的3D细胞培养模型在骨肉瘤药物筛选中的进展

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Advancement in Scaffold-Based 3D Cell Culture Models for Osteosarcoma Drug Screening

本综述系统阐述了支架型三维（3D）骨肉瘤（OS）模型在药物筛选领域的重大进展。文章指出，传统二维（2D）培养难以模拟体内肿瘤微环境（TME），而支架型3D模型（如基于水凝胶、脱细胞支架、微流控芯片等）能更好地复现骨肉瘤的病理生理特征，尤其在研究细胞-细胞外基质（ECM）相互作用、药物耐药性（如对MAP方案：甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂）及个性化医疗方面展现出巨大潜力，为 bridging the gap between experimental research and clinical application 提供了更可靠的平台。

　　

1. 引言

骨肉瘤（OS）是一种极具侵袭性的骨恶性肿瘤，好发于儿童和青少年。尽管手术技术和化疗方案不断进步，但由于其高转移倾向、对常规疗法的耐药性以及缺乏早期检测的特异性生物标志物，患者的预后仍然不理想。传统二维（2D）细胞培养系统无法准确模拟体内复杂的肿瘤微环境（TME），这导致临床前研究结果向临床成功转化的效率有限。为了克服这些局限性，研究领域已转向三维（3D）培养系统，它能更精确地模拟天然OS TME的空间、机械和生化特征。本综述重点聚焦于基于支架的3D OS模型，系统探讨其演变、现状及在药物筛选中的应用。

2. 3D OS球体模型

虽然本综述主要关注基于支架的OS模型，但球体系统作为最早、最易获得的3D肿瘤培养形式，为后续支架系统的演进奠定了基础。3D球体模型是在无支架培养基中形成的自聚集3D细胞簇。OS球体除了能改善对化疗的临床反应性和推进个性化癌症护理外，还可作为研究细胞-细胞和细胞-基质相互作用的协同效应的模型。然而，支架无球体模型在复制TME中复杂的细胞-ECM相互作用方面能力有限。为了弥补这一不足，开发了将OS细胞与基质细胞（如间充质干细胞MSCs）共培养的混合球体模型，这些模型在评估药物反应（如对阿霉素DOX的反应）方面显示出重要性，强调了ECM在药物筛选中的关键作用。

3. 基于支架的3D OS培养模型

3.1. 水凝胶基支架：混合/复合支架

水凝胶是由亲水聚合物形成的3D网络，能吸收大量水分而不丧失结构完整性，因其高生物相容性、可调的机械性能、生物降解性和类似ECM的特性而被广泛应用。常用的天然水凝胶材料包括明胶（Gelatin）、胶原蛋白（Collagen）、藻酸盐（Alginate）和壳聚糖（Chitosan），而合成材料如聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等也常被使用。例如，明胶甲基丙烯酰（GelMA）和基质胶（Matrigel）是两种常用的天然来源生物材料。研究表明，封装在10% GelMA和Matrigel水凝胶中的MG-63 OS球体表现出增强的侵袭潜力和对劳拉替尼（Lorlatinib）更高的敏感性。水凝胶还可作为药物递送平台，通过其多孔结构实现局部治疗。例如，将GelMA与氧化葡聚糖（GOMP）结合形成双网络水凝胶，能够响应酸性pH和高温条件，增强阿霉素（DOX）的控释效果，提高局部肿瘤治疗的疗效。

3.2. 大孔水凝胶支架

3.2.1. 冷冻凝胶支架

冷冻凝胶是通过冷冻-解冻法在零度以下温度合成的大孔水凝胶，具有独特的互连孔隙、优异的机械鲁棒性和弹性。虽然目前直接用于OS治疗的研究有限，但其在骨再生方面的应用显示出潜力。例如，壳聚糖-明胶冷冻凝胶可作为骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的递送载体，促进骨矿化和成骨作用。负载MXene（Ti₃C₂）的冷冻凝胶能在近红外（NIR）照射下消融OS细胞，并释放锶/铜/硅离子促进新骨形成，展示了多模式治疗整合的潜力。

3.2.2. 微球支架

微球支架能确保一致的孔径、增强孔隙连通性，并最大化表面积，从而实现药物的最大化和可控递送。例如，通过光交联技术制备的蜂窝状多孔GelMA水凝胶微球，为OS细胞提供了仿生微环境，有助于细胞保持其自然特性和成瘤能力。负载抗癌药物（如5-氟尿嘧啶、紫杉醇或顺铂）的微球可以抑制OS细胞迁移并诱导凋亡。将载有阿霉素（ADM）的明胶/PLGA微球锚定在脱细胞骨膜支架上，能够持续释放药物并抑制癌细胞生长。

3.3. 脱细胞支架

脱细胞骨支架，特别是脱矿骨基质支架（dBMS），能模拟天然ECM组成，为构建体外疾病模型提供了生理相关环境。研究表明，dBMS具有良好的生物相容性，能维持天然骨基质的成分（如羟基磷灰石HA和I型胶原），促进OS细胞增殖并形成类器官结构。OS细胞在dBMS中能够持续存在并对DOX等药物产生耐药性，这与体内反应相似，使其成为筛选新化疗方案的有力工具。

3.4. 微流控芯片：骨肉瘤芯片

微流控芯片用于创建3D OS模型，能比传统2D培养更准确地复制体内组织的结构和功能。通过集成三细胞培养系统（包括肿瘤细胞、基质细胞）和微流体灌注，可以模拟动态的体内生理拟态条件，从而更好地评估抗癌药物的疗效。例如，利用双挤出式3D生物打印技术开发的骨肉瘤芯片（OOC）模型，通过CXCL12/CXCR4信号传导模拟了OS的侵袭性和转移加速过程。药物筛选实验表明，普乐沙福（Plerixafor）与DOX联用能显著增强DOX对患者来源OS细胞的杀伤作用。

3.5. 纳米颗粒/脂质体结合支架

纳米颗粒因其高表面积体积比，能有效在支架上运输氧气、营养物质和药物。羟基磷灰石纳米颗粒（nHA）由于其强吸附性和生物相容性，在OS药物递送中应用广泛。将nHA掺入明胶基微带支架中，可以紧密复制体内骨的胶原-矿物质基质。研究发现，含有HA的支架比2D培养和缺乏HA的3D模型对DOX表现出显著更高的耐药性。将载有吉西他滨（GEM）盐酸盐的脂质体与GelMA水凝胶光交联，构建的多功能植入物显示出持续的药物释放和抗肿瘤特性。

4. 模拟骨肉瘤TME

4.1. 影响OS进展的物理化学因素

支架的刚度显著影响OS细胞的行为，增加的刚性会促进细胞增殖、迁移和化疗耐药性。例如，在不同刚度的3D打印GelMA水凝胶中，较硬的水凝胶激活了YAP/TAZ等机械转导通路，增强了恶性表型。支架的孔隙率对于确保足够的营养和氧气交换以及有效的细胞浸润至关重要。支架的生化组成，特别是包含骨仿生矿物质如HA，会影响OS细胞行为。HA能促进成骨分化，并为OS细胞生长提供有利环境，支持癌症干细胞（CSC）表型的维持，并上调与干性和肿瘤侵袭性相关的基因（如NOTCH-1和HIF-1α）。

4.2. 影响OS进展的细胞因素

OS TME包含多种细胞类型，如间充质干细胞（MSCs）、成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞、免疫细胞和脂肪细胞。肿瘤细胞与这些细胞相互作用，驱动骨溶解破坏、免疫逃避、血管生成和骨重塑失调。例如，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）与OS细胞相互作用后，分化为癌症相关成纤维细胞（CAFs），并分泌IL-6、IL-8和MCP-1等细胞因子，共同促进OS的侵袭性、运动性和跨内皮迁移。构建包含OS肿瘤细胞、MSCs和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的多细胞肿瘤球体（MCTS），能更准确地模拟TME，提高药物筛选的效力。

5. 仿生OS模型中的耐药动力学：2D vs 3D

与2D模型相比，3D系统能更准确地再现体内细胞现象。大量研究一致表明，在3D支架中培养的OS细胞比2D培养的细胞能更有效地抵抗化疗药物。这是因为3D培养的复杂基质（包含OS生态位和天然ECM成分）是增强OS细胞抗癌药物耐药性的原因。此外，骨仿生天然材料（如HA）与更高的耐药性相关，因为它们被发现能增强耐药表型，这与体内模型和患者来源的肿瘤反应一致。因此，药物（包括MAP方案和非MAP药物）的半数抑制浓度（IC₅₀）值通常高于2D单层培养，表明3D OS模型表现出更高的耐药性。除了增强耐药性外，将OS细胞与基质成分在支架中共培养，还能增加ECM中的成骨分化、矿化和血管生成。

6. 挑战与未来展望

尽管基于支架的3D OS模型取得了显著进展，但仍面临一些关键挑战。骨TME的复杂性难以在体外完全复现。天然生物材料的机械强度和耐久性有限，而合成聚合物可能引起细胞毒性或免疫反应。标准化和可重复性也是重大障碍。将多种细胞类型整合到模型中增加了复杂性，但对于准确模拟TME至关重要。从转化角度看，这些模型用于高通量药物筛选的可扩展性仍然有限，将体外药物反应与临床结果相关联仍是一个主要挑战。未来，先进的生物材料、患者来源的细胞和器官样技术、3D生物打印和微流体集成等生物制造技术，以及协议标准化和高内涵分析工具的融合，有望推动下一代支架型3D模型的发展，加速有效疗法的发现并加深对OS生物学的理解。

7. 结论

本综述批判性地概述了用于OS研究和药物筛选的支架型3D细胞培养模型的当前格局。支架型3D模型通过更忠实地复制OS TME的结构、机械和生化复杂性，比传统2D培养具有显著优势。这些模型能够更准确地表征肿瘤-基质相互作用、耐药机制以及细胞对治疗的反应，从而在临床前药物测试预测方面弥合转化鸿沟。基于支架的系统，特别是那些利用仿生和可调材料的系统，为基础研究和个性化医学策略的开发提供了多功能平台。未来的进步有望进一步增强这些模型的生理相关性和转化效用。总之，本综述强调了支架型3D培养系统作为OS药物发现和个性化治疗的变革性工具的前景，同时强调了持续创新和严格验证的必要性，以将这些模型确立为临床前研究的标准平台。