基于定量表面增强拉曼散射（Quantitative SERS）的夹心杂交检测方法用于核酸分析

《ACS Omega》：Quantitative SERS-Based Sandwich-Hybridization Assay for Nucleic Acid Detection

基于SERS的DNA夹心杂交检测法研究，采用TAMRA标记纳米颗粒探针和生物素表面探针，通过亲生物素结合捕获目标DNA形成夹心结构，实现新冠病毒基因的高灵敏检测。量化分析采用传统单峰高度法与二进制图像法，结合AFM验证纳米颗粒分布，数字图像法使校准线性度提升4.4%，相关系数达0.99，检测限1.4 nM。

　　本研究围绕表面增强拉曼散射（SERS）技术在生物分子检测中的应用展开，重点探讨了一种基于SERS的夹心杂交检测方法，用于病毒（SARS-CoV-2）RNA对应的DNA检测。该方法利用商业可得的材料和标准的生物偶联步骤，避免了复杂的合成过程，从而实现了简便、高效的检测流程。通过将TAMRA标记的DNA偶联到金纳米颗粒（AuNPs）上，形成具有识别和信号传递功能的SERS探针，结合生物素标记的表面DNA链，能够实现对目标DNA的高灵敏度和高特异性检测。当目标DNA与探针结合时，形成完整的夹心结构，并通过生物素-链霉亲和素（avidin–biotin）相互作用被固定在链霉亲和素包被的玻璃表面。最终的拉曼信号来源于TAMRA报告染料，通过共振和等离子体增强效应实现了对目标分子的高灵敏度检测。

SERS技术因其在生物分子检测中的高灵敏度和高特异性而受到广泛关注，特别是在病毒DNA检测领域。传统上，实时逆转录聚合酶链反应（rRT-PCR）是检测病毒感染的黄金标准，但其在引物设计和结果准确性方面存在一定的局限性。因此，开发新的、更高效的病毒DNA检测方法显得尤为重要。SERS技术通过金属表面或纳米颗粒的增强作用，能够显著提升拉曼信号的强度，从而实现对低浓度目标分子的检测。然而，定量SERS测量仍面临一些挑战，例如信号的不稳定性、背景噪声以及仪器参数的波动。通过优化实验条件和采用数字图像分析方法，可以提高SERS信号的稳定性，从而增强检测的准确性。

在本研究中，SERS探针的制备采用了简便的冷冻技术，将TAMRA标记的DNA偶联到AuNPs上。该方法不仅操作简单，还适用于各种DNA序列，能够形成致密的DNA层。通过扫描电子显微镜（SEM）对AuNPs进行表征，可以观察其形态和尺寸分布，确保探针的均匀性和一致性。紫外-可见光谱（UV–vis）分析进一步验证了DNA修饰后AuNPs的等离子体共振（LSPR）峰发生了明显的红移，表明DNA成功结合到了AuNPs表面。Raman光谱则用于评估探针的性能，选择最强烈的峰作为后续分析的特征峰。

为了提高检测的准确性和可靠性，本研究优化了多个实验参数，包括杂交时间和盐浓度。通过调整这些参数，能够确保目标DNA与探针之间的高效结合，同时减少非特异性结合和纳米颗粒聚集的影响。AFM被用于表征样品，通过分析不同浓度下AuNPs的分布情况，验证了SERS信号与目标DNA浓度之间的正相关关系。此外，AFM和SERS结果之间的强相关性进一步证明了该方法的准确性和可靠性。

在检测过程中，采用两种分析方法：一种是基于单点峰高度的光谱分析，另一种是基于数字图像的分析。单点分析虽然能够提供目标DNA的浓度信息，但其准确性可能受到背景噪声和峰偏移的影响，特别是在低浓度情况下。相比之下，数字图像分析通过将SERS信号转化为二进制数据，能够有效减少信号波动，提高检测的灵敏度。通过比较这两种方法，可以确定最准确和实用的解决方案。

此外，本研究还探讨了SERS信号的定量分析方法，通过建立特征峰的强度与目标DNA浓度之间的校准曲线，实现了对目标DNA的定量检测。在优化实验参数后，观察到SERS信号强度随着目标DNA浓度的增加而增加，但该关系并非线性。通过使用半对数坐标和双对数坐标对数据进行线性化处理，能够提高检测的线性度和准确性。AFM和SERS结果之间的强相关性表明，纳米颗粒的聚集对SERS信号的影响较小，从而确保了信号的稳定性。

在选择性测试中，通过分析与目标DNA长度相同的错配序列，验证了该夹心杂交检测方法的特异性。结果表明，目标DNA与探针之间的杂交反应能够产生显著的SERS信号，而错配序列则无法引起明显的信号变化，信号与空白样品重叠。这表明该方法能够有效区分目标DNA和非目标序列，从而提高检测的特异性。

综上所述，本研究开发了一种基于SERS的夹心杂交检测方法，用于快速检测流行病相关的DNA。该方法结合了数字信号分析，提高了校准曲线的线性度和定量可靠性。通过AFM和SERS结果的强相关性，验证了该方法的准确性和稳定性。选择性测试进一步证明了该方法能够有效区分目标DNA和非目标序列，为生物分析提供了有力的工具。本研究的结果表明，SERS技术在生物分子检测中具有广阔的应用前景，特别是在快速、便携和高灵敏度检测领域。