载有小檗碱的碳纳米点的合成及其对抗双齿梅奇尼科维亚菌（Metschnikowia bicuspidata）的抗菌机制：基于转录组分析的见解

《ACS Omega》：Synthesis of Berberine-Loaded Carbon Dots and Their Antimicrobial Mechanism Against Metschnikowia bicuspidata: Insights from Transcriptomic Analysis

碳点负载小檗碱（B-CDs）通过水热法合成，具有优异的分散性和生物相容性。其对米氏腐霉菌的最低抑菌浓度为0.031 mg/mL，显著优于纯小檗碱（1 mg/mL）。转录组分析显示B-CDs通过下调糖酵解关键酶（如GAPDH、PGK）的表达，干扰病原菌能量代谢，导致细胞膜破裂和代谢崩溃。该纳米材料兼具高效抗菌性、低毒性及环境友好性，为水产病害绿色防控提供新策略。

　　在水产养殖领域，病原微生物对可持续发展构成了重大威胁。其中，一种名为*Metschnikowia bicuspidata*的病原酵母，因其引起的“乳白病”而对中华绒螯蟹（*Eriocheir sinensis*）的养殖产生严重影响。该病原体能够分泌胞外水解酶，这些酶会破坏宿主的肝胰腺组织，导致腹部积水和免疫系统崩溃。此外，其强大的环境适应能力使得传统的控制措施效果有限。因此，迫切需要开发高效、低毒、环境友好的新型抗菌剂。

目前，水产养殖中的病害防控面临两大技术瓶颈。一方面，合成化学药物虽然具有快速的抗菌效果，但长期使用容易导致耐药性和残留毒性，这不仅影响水产动物的健康，还可能对生态环境造成潜在危害。例如，氟康唑对*Candida albicans*的最低抑菌浓度（MIC）随着连续传代而降低，表明耐药性的发展。另一方面，天然抗菌化合物虽然通常对环境较为安全，但它们往往存在稳定性差、抗菌谱窄的问题。例如，生蒜提取物在储存过程中容易发生降解，需要低温、避光保存，而这些条件与实际水产养殖环境不兼容。

为了解决这些问题，近年来的研究集中于将纳米材料与天然生物活性化合物结合，以应对水产养殖中的病原微生物。例如，小檗碱是一种异喹啉生物碱，通过抑制酵母细胞中的麦角甾醇合成并诱导活性氧（ROS）的产生，展现出显著的抗真菌特性。然而，其在水中的溶解性差和细胞膜渗透性有限，限制了其在水产养殖中的应用。碳点（CDs）因其高比表面积、可调表面功能以及良好的生物相容性，逐渐成为天然药物输送的有前景的载体。例如，氨基功能化的CDs可以通过静电相互作用在真菌细胞壁中积累，从而将局部药物浓度提高3到5倍。此外，CDs可以通过其固有的氧化应激诱导能力增强小檗碱的抗菌效果。例如，维生素C负载的CDs对水产病原微生物表现出最低抑菌浓度低至20.6 μg/mL，具有持续释放的特性，延长了药物的有效期。相比传统的纳米材料如银纳米颗粒，CDs展现出更好的环境降解性，从而降低了生态风险。

基于上述背景，本研究旨在合成小檗碱负载的碳点（B-CDs），以实现对*M. bicuspidata*感染的靶向预防和控制。通过转录组分析，将阐明B-CDs的多靶点作用机制。此外，本研究还将系统地探讨B-CDs的合成过程、结构特征与功能性能之间的关系。这些研究结果有望为水产养殖中真菌病害的绿色、精准和可持续管理提供理论基础和技术支持。

在材料与方法部分，B-CDs的合成采用水热法。具体而言，将60 mg的小檗碱溶解于60 mL的超纯水中，并充分混合。随后，将混合液转移至特氟龙衬套不锈钢高压釜中，在170 °C下进行水热处理8小时。处理后的混合液冷却至室温，并通过0.22 μm的注射过滤器过滤。最后，将过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到橙黄色粉末，作为最终的B-CDs。

*M. bicuspidata*的培养则在YPD液体培养基中进行，温度为28 °C，同时以200 rpm的频率摇晃培养。在对数生长期收集菌体，并调整至1 × 103 cfu/mL的浓度，用于后续的应激实验。抗菌活性测定采用微量稀释法，依据临床与实验室标准协会（CLSI, 2020）推荐的方法进行。测试化合物溶解于培养基中，并进行2倍稀释，得到10种不同浓度。每孔加入100 μL的各浓度溶液，随后加入100 μL的*M. bicuspidata*悬液。第11列作为空白对照（仅含RPMI 1640培养基），第12列作为阳性生长对照（仅含真菌悬液）。培养板在28 °C下培养24小时后，通过观察真菌生长情况确定最低抑菌浓度（MIC）。培养结束后，取100 μL的液体涂布板进行验证最低杀菌浓度（MBC）。

为了进一步分析B-CDs对*M. bicuspidata*的影响，进行了转录组测序。将1 mL的B-CD溶液（1 mg/mL）与*M. bicuspidata*悬液（1 × 103 cfu/mL）共培养12小时，以分析其诱导的基因表达变化。随后，将菌体离心（5000 rpm，10分钟），得到细胞沉淀后立即在液氮中冷冻，并在-80 °C条件下保存，用于后续的RNA提取和转录组分析。基因表达水平通过每百万映射读数的千碱基片段数（FPKM）方法进行标准化。显著差异表达基因的判定标准为错误发现率（FDR）< 0.05且对数2倍变化（log2 fold change）的绝对值≥1。差异基因分析使用R语言中的DESeq2包进行。

基因ID转换通过R语言中的AnnotationDbi和clusterProfiler包完成，随后对细胞成分（CC）、分子功能（MF）、生物过程（BP）以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行富集分析。富集条件为*p* < 0.05。结果表明，B-CDs显著影响*M. bicuspidata*的代谢过程，主要通过下调关键的糖酵解酶来实现。这些差异表达基因在糖代谢和信号传导通路中具有重要作用。此外，KEGG富集分析进一步揭示了这些差异表达基因在24条通路中的显著富集，其中大多数涉及代谢过程中的糖代谢。这些基因的表达下调，表明B-CDs能够抑制这些通路的表达，从而影响病原微生物的生长和繁殖。

在结果部分，对B-CDs的结构特征进行了详细分析。X射线衍射（XRD）分析显示，B-CDs在约2θ = 24°处出现宽泛的衍射峰，对应于石墨碳的（002）晶面，表明B-CDs具有短程有序的石墨结构。透射电子显微镜（TEM）图像显示，CDs呈现球形或近似球形，分布较为均匀，粒径主要集中在0.5至3 nm之间。观察到的晶格条纹证实了其纳米晶体特性。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）清晰地展示了B-CDs表面丰富的功能基团。3400 cm?1处的宽谱带归因于O–H伸缩振动，表明存在广泛的氢键；而1660 cm?1处的强吸收对应于C═O伸缩，暗示存在酰胺或羧基。这些含氧功能基团不仅赋予CDs良好的亲水性，还可能通过与微生物细胞表面的相互作用增强其抗菌性能。紫外-可见吸收光谱显示，B-CDs在280、350和420 nm处出现明显的吸收峰。在420-500 nm波长范围内观察到激发依赖的荧光，随着激发波长的增加，发射峰出现红移。B-CDs在420 nm处表现出最强的发射峰，对应于蓝色荧光。

X射线光电子能谱（XPS）分析进一步揭示了CDs的化学组成。结果显示，CDs主要由碳、氮和氧组成，分别在285、400.01和530.80 eV处出现主要结合能峰。C 1s谱带（图1G）可分解为三个峰：284.6 eV（C–C/C═C）、286.1 eV（C–O/C–N）和288.5 eV（O–C═O），表明CDs中存在sp2石墨碳和含氧功能基团。N 1s谱带（图1H）显示在399.8 eV处出现一个峰，对应于吡咯氮（C–N–C），证实了小檗碱中的氮元素成功掺杂到CDs结构中。O 1s谱带（图1I）显示在531.5 eV处出现一个峰，对应于羧基氧（O═C–O）。

Zeta电位测量显示，B-CDs在25 °C下的表面电位为22.52 ± 0.03 mV，表明其胶体体系具有良好的静电稳定性。粒子浓度约为1.2 × 101?个/mL，进一步证实了其在水溶液中的良好分散性。

在抗菌活性实验中，使用微量稀释法测定B-CDs的MIC为0.031 mg/mL，MFC为0.5 mg/mL。扫描电子显微镜（SEM）结果显示，当B-CDs浓度为1 mg/mL时，*M. bicuspidata*的细胞膜出现破裂现象。这表明B-CDs能够有效破坏病原微生物的细胞结构，从而发挥抗菌作用。

转录组分析进一步揭示了B-CDs对*M. bicuspidata*的抗菌机制。经过测序，每个样本的测序数据至少达到5.4 G，且Q30值大于98%，表明测序质量较高。主成分分析（PCA）显示，实验组与对照组样本能够良好聚类，表明样本间的可区分性。差异基因分析显示，共鉴定出309个差异表达基因，其中280个基因表达下调，29个基因表达上调。为了验证RNA测序数据的可靠性，对其中8个代表性差异表达基因的表达水平进行了定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测。结果显示，RNA测序与qRT-PCR数据之间存在强线性相关性，进一步验证了转录组分析的可靠性。差异表达基因的GO富集分析显示，共有41个显著富集的GO术语，其中最显著富集的通路为糖酵解。糖酵解是细胞代谢的核心过程，为细胞提供必要的能量。关键酶如GAPDH、PGK和三磷酸异构酶的表达下调，导致细胞能量供应不足，从而抑制病原微生物的生长和繁殖。

KEGG富集分析进一步揭示了差异表达基因在24条通路中的显著富集，其中大多数涉及代谢过程中的糖代谢。这些基因的表达下调表明，B-CDs能够抑制这些通路的表达，从而影响病原微生物的生长和繁殖。此外，B-CDs还影响生物过程中的内分泌系统，表明其抗菌作用不仅局限于代谢过程，还可能涉及更广泛的生物调控机制。

在讨论部分，B-CDs的结构特征与其抗菌性能密切相关。近年来，CDs因其优良的光学性能、良好的生物相容性以及独特的结构特征，在生物医学领域受到广泛关注。CDs在药物输送、成像探针和抗菌治疗方面展现出巨大的潜力。本研究中，通过水热法合成的B-CDs在粒径、表面功能化和光学性能方面具有显著优势。XRD分析显示，B-CDs具有石墨结构，表明其在纳米尺度上具有一定的结晶性，这对于其稳定性和抗菌活性至关重要。

进一步通过TEM和XPS分析对B-CDs的形态和表面组成进行研究。TEM图像显示，B-CDs具有相对均匀的纳米颗粒大小分布（0.5–3 nm）。XPS分析表明，B-CDs的表面富含氧化基团（如羧基和羰基）并掺杂了氮原子。这些功能基团不仅增强了B-CDs的水溶性和生物相容性，还可能通过与微生物细胞表面的相互作用增强其抗菌性能。此外，氮掺杂进一步改善了B-CDs的光学性能，使其在生物成像和治疗中具有潜在应用。

B-CDs的抗菌活性显著高于纯小檗碱。这一现象可能与CDs的纳米尺度特性和其表面功能基团的生物相容性密切相关。作为传统的天然抗菌剂，小檗碱的水溶性较差，生物利用度低。而B-CDs的水溶性和细胞渗透性优于小檗碱，从而提高了其抗菌效果。此外，B-CDs的靶向药物释放机制有助于减少对环境的负面影响，并提高药物在生物系统中的有效性。可能的抗菌机制包括抑制微生物的增殖路径。例如，银纳米颗粒通过干扰真菌的糖酵解和氧化磷酸化路径来抑制*C. albicans*的生长，表明纳米材料可能具有共同的杀菌机制。此外，纳米酶通过调控肿瘤细胞的葡萄糖代谢，诱导肿瘤细胞凋亡，进一步支持这一假设。

B-CDs的抗菌机制进一步通过转录组分析得以阐明。差异基因分析显示，B-CDs显著下调了糖酵解路径中的多个关键酶的表达，包括GAPDH、PGK和三磷酸异构酶。糖酵解是细胞代谢的核心过程，为细胞提供必要的能量。GAPDH的表达下调导致细胞能量供应不足，从而抑制病原微生物的生长和繁殖。这一抑制糖酵解的效应是B-CDs抗菌机制的关键部分。其他纳米材料如银纳米颗粒也通过类似机制抑制真菌生长，即通过干扰其糖酵解和氧化磷酸化路径，减少细胞的能量供应。此外，纳米酶通过调控肿瘤细胞的代谢路径，诱导肿瘤细胞凋亡，进一步支持这一假设。这些研究结果表明，B-CDs通过靶向糖代谢路径，改变病原微生物的能量代谢，从而发挥抗菌作用。

B-CDs的抗菌活性增强可能与其表面功能基团与细胞的相互作用有关。通常，纳米材料通过提高药物的溶解性和细胞渗透性，增强其生物利用度和抗菌活性。在本研究中，B-CDs的抗菌活性显著高于纯小檗碱。这一结果可能归因于CDs不仅具有更高的溶解性，还能产生ROS，破坏细胞膜的完整性，最终导致病原微生物死亡。这种ROS的产生是B-CDs抗菌活性增强的重要机制。

在应用前景方面，随着耐药性病原微生物的增加，开发新型抗菌材料已成为紧迫的任务。作为一种新型抗菌材料，B-CDs具有良好的生物相容性、环境友好性和可调光学性能，为抗菌治疗提供了有前景的替代方案。除了低毒性外，B-CDs还能通过靶向药物输送提高治疗效果。此外，其强荧光特性使其在生物成像中具有应用潜力，从而拓展其在医学和水产养殖中的应用范围。

未来的研究应进一步探讨B-CDs对其他水产病原微生物的控制效果，并优化其合成方法以提高稳定性和抗菌效率。同时，应关注B-CDs的环境降解性和长期安全性，以确保其在实际应用中的可持续性。这些研究不仅有助于解决当前水产养殖中的抗菌难题，也为绿色、精准和可持续的病害防控提供了新的思路和方法。