基于模型的过程优化：通过CuAAC点击化学实现三价配体与siRNA的 conjugation

《ACS Omega》：Model-Assisted Process Optimization for Trivalent Ligand-siRNA Conjugation via CuAAC Click Chemistry

siRNA靶向递送研究通过CuAAC点击化学系统优化四参数（azide equivalents、oligo浓度、pH、配体/铜比），建立稳定工艺空间并验证规模化生产可行性，解决多价连接效率及杂质控制难题，为RNAi疗法临床转化提供技术支撑。

　　siRNA作为一种高效的基因治疗工具，在癌症和遗传病的治疗中具有重要作用。其独特的优势在于能够精准地沉默特定基因，从而实现对疾病相关分子的调控。然而，siRNA在体内应用时面临诸多挑战，如其快速的肾脏清除、酶促降解以及细胞摄取效率较低。这些问题限制了siRNA在临床中的广泛应用。为了解决这些障碍，化学修饰策略被广泛采用以提高RNA治疗药物的稳定性和靶向能力。此外，通过将靶向配体与siRNA分子进行共价偶联，成为增强siRNA靶向递送的关键手段。其中，铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）因其高反应性、特异性以及良好的生物相容性，成为构建多价靶向配体-RNA偶联物的主流方法之一。

本研究旨在系统优化CuAAC点击化学反应，以合成三价靶向配体-RNA偶联物。通过设计实验筛选，确定了四个关键影响因素：叠氮等价物、寡核苷酸浓度、反应pH值以及配体与铜催化剂的比例。研究结果明确了这些参数的最佳设计空间，为大规模生产多价配体-RNA偶联物提供了标准化的解决方案。这一进展不仅提升了反应效率，还显著加速了RNA干扰治疗药物的临床转化过程。

在siRNA治疗药物的开发中，靶向配体的共价偶联是实现组织特异性递送的核心步骤。传统的脂质体或纳米颗粒载体虽然被广泛应用，但它们往往缺乏足够的靶向性和递送效率。相比之下，化学偶联策略能够直接将siRNA与具有生物活性的配体结合，从而实现更精确的药物分布，同时减少系统性毒性。以Alnylam公司开发的三价GalNAc修饰siRNA为例，该药物能够高效地靶向肝细胞并实现显著的基因沉默效果。近年来，研究人员在非肝脏靶向递送方面取得了重要突破，包括中枢神经系统、肺部、眼部、脂肪组织、肌肉和肿瘤等。这些进展表明，构建具有高度靶向性的siRNA药物分子是当前RNA治疗领域的重要研究方向。

CuAAC反应作为点击化学的一种经典方法，已被广泛应用于生物大分子的偶联反应中。然而，在多价siRNA偶联过程中，仍然存在一些挑战。例如，小分子核苷酸通常具有较高的极性和良好的水溶性，而常见的靶向配体往往表现出较强的疏水性，这可能导致溶解困难和反应体系的不均匀分布。此外，核苷酸骨架与小分子之间的静电相互作用以及空间位阻效应，也可能降低反应效率。因此，如何在保证反应效率的同时，控制反应条件以避免siRNA降解，成为优化CuAAC反应的关键问题。

为了系统地评估反应体系的性能，本研究采用了一种综合的分析方法，基于反相高效液相色谱-质谱联用技术（RP-HPLC-MS），能够准确区分未反应的寡核苷酸、单分支杂质、双分支杂质以及目标产物。通过分析这些成分的保留时间，研究人员确定了双分支杂质作为关键风险杂质，需要严格控制。此外，其他杂质的保留时间与目标产物存在明显差异，因此被归类为“其他杂质”，对纯化过程的影响相对较小。基于这些分析，研究团队设定了反应效率的关键响应指标，包括粗产物收率≥70%、粗产物纯度≥75%、其他杂质≤25%以及双分支杂质<0.5%。这些标准为后续的参数优化提供了明确的指导。

在初步实验中，研究团队通过实施一种确定性筛选设计（DSD），对10个反应参数进行了系统分析，最终确定了7个关键影响因素。这些因素包括配体类型、配体与铜催化剂的比例、反应pH值、寡核苷酸浓度、叠氮等价物、反应温度和反应时间。其中，配体类型对反应效率具有多重影响。例如，三（1-苯基-1H-1,2,3-三氮杂环丙烯基）甲胺（TBTA）作为配体，在高铜离子浓度下容易形成胶体沉淀，破坏反应体系的均匀性，并影响大规模生产的可行性。相比之下，三（3-羟基丙基三氮杂环丙烯基）甲胺（THPTA）表现出优异的水溶性和铜离子螯合稳定性，能够在反应体系中保持均匀性，同时具有良好的兼容性，特别适用于高水溶性的siRNA反应物。此外，THPTA还能有效中和反应过程中产生的活性氧物种（ROS），从而减少对生物分子的损伤，降低杂质的生成。因此，THPTA被选定为固定配体。

反应时间对反应效率的影响相对较小，主要表现为对收率和纯度的敏感性较低。因此，在初步筛选实验中，研究团队将反应时间固定为1.5小时。这一选择不仅简化了实验流程，还确保了反应的稳定性。同样，反应温度对反应动力学具有重要影响，但过高的温度可能加速siRNA的降解，而过低的温度则会降低反应速率。实验数据显示，25摄氏度能够提供最佳的催化性能，同时兼顾反应的可行性和工业生产的复杂性。因此，反应温度被设定为25摄氏度。通过上述筛选，研究团队确定了三个固定参数，即配体类型（THPTA）、反应温度（25 °C）和反应时间（1.5小时），并将优化重点放在四个连续变量上：叠氮等价物、寡核苷酸浓度、反应pH值和配体/铜比例。

在进一步的优化过程中，研究团队采用了路径陡度上升（PSA）方法，以确定最优的反应条件。通过对六组实验数据的分析，研究发现，在条件2-3（叠氮等价物为14，反应pH值为8.5，配体/铜比例为7，寡核苷酸浓度为1.34 mM）下，反应收率、纯度以及杂质水平均达到最佳状态。因此，这一条件被选为后续优化的起点。随后，研究团队采用响应面法（RSM）的中心组合设计（CCD）方法，对四个关键变量进行了更深入的探索。通过扩展实验范围，研究团队成功建立了更全面的反应模型，并验证了其在不同反应条件下的稳定性。

研究结果显示，优化后的反应体系在多个关键指标上均表现出优异的性能。例如，在验证实验中，反应收率和纯度均达到了设定的目标，而双分支杂质的含量接近于零，表明优化后的反应条件能够有效控制杂质的生成。此外，通过将反应条件逐步放大至10倍、30倍和60倍的规模，研究团队验证了该优化方案在工业生产中的可行性。实验结果表明，优化后的反应参数能够在不同规模下保持一致的性能，从而为大规模生产提供了坚实的基础。

在多价靶向配体-RNA偶联物的开发中，三价结构通常表现出优于二价或单价结构的靶向结合能力。这是因为三价结构能够通过多点结合增强与靶标受体的相互作用，从而提高药物在体内的靶向效率和治疗效果。因此，本研究中通过精确控制偶联效率，并有效抑制单分支和双分支杂质的生成，为新型siRNA治疗药物的开发提供了重要支持。优化后的反应体系不仅适用于当前研究中的特定配体和siRNA序列，也为其他类型的寡核苷酸-配体偶联物的开发提供了可借鉴的框架。

为了确保反应体系的稳定性，研究团队还对反应过程中可能产生的ROS进行了分析。铜离子在催化反应过程中可能引发ROS的生成，从而导致siRNA的降解。然而，优化后的反应体系能够有效控制铜离子的浓度和配体/铜比例，从而减少ROS的生成，降低siRNA的降解风险。实验数据显示，优化后的反应体系中siRNA的降解率显著低于未优化的对照组，进一步验证了该优化方案的有效性。

综上所述，本研究通过系统优化CuAAC点击化学反应，为三价靶向配体-RNA偶联物的高效合成提供了科学依据和实验支持。优化后的反应条件不仅能够提高反应效率，还能有效控制杂质的生成，确保药物的质量和稳定性。此外，研究团队还验证了该优化方案在不同规模下的适用性，为大规模生产奠定了基础。未来，随着研究的深入，该方法还可以应用于其他类型的寡核苷酸-配体偶联物的开发，为RNA治疗药物的工业化生产提供更加广泛的技术支持。