牛肉肌浆膜在聚离子涂层电极上的电子转移与氧还原动力学研究

《ACS Electrochemistry》：Electron Transfer and Oxygen Reduction Kinetics of a Beef Sarcoplasm Film on a Polyion-Coated Electrode

肉色变化的电化学分析：通过聚离子修饰电极直接研究牛肉 sarcoplasm薄膜的电子转移动力学与氧还原催化行为，发现其异质电子转移速率常数（27.1 s?1）和米氏常数（722 μM）与纯肌红蛋白接近，证实肉基质中肌红蛋白主导的氧化还原过程，为开发基于肉提取物的电化学传感器提供理论依据。

　　本研究通过电化学方法直接探测天然生物样本，而非孤立的蛋白质或辅因子，从而在组织和细胞水平上提供了对基本机制的全面认识。电化学方法在研究生物样本时具有重要价值，因为它能够揭示样本中复杂的生物分子相互作用，以及这些分子在特定环境下的动态变化。传统的研究方法通常依赖于对单一蛋白质的分析，而本研究首次直接分析了牛肉长肌（longissimus lumborum muscle）的肌浆膜（sarcoplasmic film）样本，使用聚离子修饰的石墨电极进行电化学检测。这种研究方法不仅拓宽了我们对肉品中生物分子行为的理解，也为开发更高效的生物电化学界面提供了新的思路。

肌浆膜是肌肉组织中重要的组成部分，主要由肌红蛋白（myoglobin）构成，同时也包含其他蛋白质、血红蛋白（hemoglobin）和细胞色素（cytochrome）。肌红蛋白作为红ox活性的血红素蛋白，是肉品中储存和运输氧气的主要分子。其颜色变化与第六配位位点上的配体以及铁的氧化态密切相关。在无氧环境下，肌红蛋白以去氧肌红蛋白（deoxymyoglobin）形式存在，呈现红紫色；当与氧气结合时，形成氧合肌红蛋白（oxymyoglobin），呈现鲜红色；而在氧化条件下，肌红蛋白转化为高铁肌红蛋白（metmyoglobin），导致肉品颜色变暗。因此，肌红蛋白的氧化还原特性对于理解肉品的色泽变化至关重要。

电化学方法为研究这些氧化还原特性提供了一种简便、高效且灵敏的手段。通过循环伏安法（cyclic voltammetry），可以监测肌红蛋白与电极之间的电子转移过程，并评估其对氧气的结合能力。电化学方法的优势在于其操作简单，只需要直流和电位变化的监测即可获得关键信息；同时，其成本低廉，例如石墨电极的价格仅为0.0324欧元/个；此外，电化学传感器具有良好的可重复性，能够进行多次测量而不丢失信号；其灵敏度也非常高，可以检测到极低浓度的物质，如100飞摩尔（fM）的DNA、10飞摩尔的胰岛素（insulin）以及1皮克/毫升（pg/mL）的糖蛋白（glycoproteins）。这些特性使得电化学方法成为研究肉品氧化还原行为的理想工具。

肌红蛋白作为一种经典的血红素蛋白模型，因其商业可得性、成本效益以及类过氧化物酶活性而被广泛用于研究其电化学行为。研究发现，肌红蛋白在不同pH条件下表现出不同的氧化还原特性，其中在生理pH（pH 7.4）下，其形成氧合肌红蛋白的速率更快，并且与电极之间的电子转移速率更高。这表明pH条件对肌红蛋白的氧化还原行为有显著影响。此外，一些研究还利用电化学方法检测肉类中的抗生素，如氯霉素（chloramphenicol），以及食品成分，如鸟苷酸（guanosine 5′-monophosphate, GMP），进一步验证了电化学方法在食品分析中的应用潜力。

在本研究中，我们使用了聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）修饰的石墨电极，通过电化学手段分析了牛肉肌浆膜的氧化还原特性。PEI是一种带有正电荷的聚合物，能够与带负电荷的肌浆膜在pH 5.6条件下发生静电吸附。这一过程使得肌浆膜能够在电极表面稳定存在，并有效参与氧化还原反应。研究结果表明，肌浆膜在电极表面的电活性覆盖量为23.6 ± 3.3皮摩尔/平方厘米（pmol/cm2），其准可逆的异质电子转移速率常数为27.1 ± 2.2秒?1。这些参数反映了肌浆膜与电极之间的电子转移效率，以及其在电化学反应中的行为特征。

为了进一步研究肌红蛋白对肌浆膜电化学行为的贡献，我们进行了肌红蛋白添加实验（spiking experiment）。实验中，不同浓度的肌红蛋白（4, 8, 12 mg/mL）被加入到肌浆膜溶液中，并通过电化学方法检测其对氧化还原电流的影响。结果显示，添加肌红蛋白后，氧化和还原峰电流显著增加，表明肌红蛋白是肌浆膜电化学行为的主要贡献者。此外，肌红蛋白添加后的电极表面显示出与未添加样品相似的氧化还原峰位置，进一步确认了肌红蛋白在肌浆膜中的重要性。

为了评估肌浆膜在电极表面的稳定性，我们进行了连续300次循环伏安实验，观察其在不同循环次数下的电流变化。实验结果显示，随着循环次数的增加，还原峰电流逐渐下降，表明部分生物分子可能从电极表面流失。这种流失可能是由于电极表面与肌浆膜之间结合力较弱，以及在重复电位扫描过程中，蛋白质可能经历构象变化或脱附。尽管如此，研究发现，在短时间内（如5分钟）的扫描仍能获得足够的数据用于分析，这表明该电极在实际应用中具有一定的可行性。

在研究肌红蛋白的氧结合能力时，我们采用了Michaelis–Menten动力学模型。通过改变电化学细胞中的氧气浓度，我们观察到还原电流随着氧气浓度的增加而上升，这表明肌红蛋白具有较高的氧气结合亲和力。计算得出的氧气结合亲和力常数（K_M）为722 ± 62微摩尔（μM），与孤立肌红蛋白的K_M值非常接近，进一步支持了肌红蛋白在肌浆膜中的主导作用。这一结果表明，肌浆膜中的肌红蛋白能够有效地进行氧气结合和还原反应，从而在肉品氧化还原过程中发挥关键作用。

本研究的发现具有重要的应用价值。首先，它揭示了肌浆膜中红ox活性分子的动态行为，这有助于开发基于电化学原理的肉品检测工具。其次，研究结果表明，PEI修饰的电极能够有效支持肌浆膜的吸附，并保持其良好的电化学性能。最后，该研究为理解肉类氧化还原机制提供了新的视角，有助于优化电化学传感器的设计和性能，从而推动其在食品安全和生物传感领域的应用。

总的来说，本研究通过电化学方法直接分析了牛肉肌浆膜的氧化还原行为，揭示了其与电极之间的电子转移特性以及对氧气的结合能力。这些发现不仅深化了我们对肉品氧化还原机制的理解，也为开发高效、可靠的生物电化学传感器提供了理论基础和技术支持。未来的研究可以进一步探索不同肉类和环境条件下肌浆膜的电化学行为，以及如何通过优化电极材料和修饰方法，提高电化学检测的灵敏度和特异性。此外，这些结果还可以应用于其他生物样本的分析，为生物电化学研究提供新的思路和方法。