用于分析木聚糖寡聚体的GALDI-FT-ICR-MS方法的发展

《Biomacromolecules》：Development of GALDI-FT-ICR-MS Methods for the Analysis of Xylan Oligomers

高分辨率质谱联用技术（GALDI-FT-ICR-MS）用于解析桦木木兰的结构特征，开发了固体和液体状态分析方法，优化了电离参数和溶剂体系。结果显示正负离子模式互补，固体态分析简化流程且结果可靠。结合IR和NMR验证，揭示了木兰主链的4-O-甲基葡萄糖酸酯基取代及部分乙酰化特征，为多糖资源化利用提供结构依据。

　　### 解读与分析：基于GALDI-FT-ICR-MS对桦木木聚糖的结构表征

#### 引言

植物细胞壁主要由多糖和蛋白质构成，其中在木质化的植物中还包含木质素。多糖是细胞壁中的主要成分，而半纤维素则是其中第二丰富的多糖类型，紧随纤维素之后。半纤维素是一类由戊糖和己糖组成的线性杂聚物，包括木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖等。根据其主要单糖单元，半纤维素可以分为木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖和阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖或葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖等。因此，木聚糖在植物细胞壁和植物基生物质中具有重要的地位。它们可能占双子叶植物（如桦木）次生细胞壁的20%至30%，而在单子叶植物（如禾本科植物）的初生细胞壁中，木聚糖可能占20%。木聚糖的主链通常由β-D-木糖单体通过β-1,4-糖苷键连接而成，主链也可能带有其他糖单元或衍生物，有时甚至部分乙酰化。木糖主链的取代模式与其来源密切相关，导致不同类型的木聚糖（如均木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖或葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖）的形成。

近年来，由于其环保、可再生、可生物降解和无毒的特性，生物聚合物如木聚糖受到广泛关注。它们在化学工业中具有广阔的应用前景，例如作为生产基础化学品（如糠醛、乙醇或乳酸）的原料。此外，木聚糖在生成生物聚合物薄膜方面也展现出潜力，这些薄膜可以用于可生物降解的包装或膜材料。在制药工业中，半纤维素也被认为是具有重要应用潜力的材料，它们可以作为药物制剂中的辅料，替代基于纤维素的材料，因为半纤维素不同于纤维素，能够被人类消化。此外，木聚糖还被广泛研究用于生物燃料、纳米颗粒和水凝胶等其他领域。然而，这一研究领域面临的重要挑战是木质纤维素生物质的高复杂性，以及半纤维素组成和结构的变异性，这种变异性取决于其来源和提取过程。因此，为了充分挖掘这些化合物的潜力并探索其在新领域的应用，理解其性质和结构至关重要。

#### 实验方法

在本研究中，开发了一种基于石墨辅助激光解吸/电离（GALDI）结合傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR-MS）的分析方法，用于表征木聚糖的可溶性和不可溶性成分。该方法在液态和固态下均进行了测试，并且在正负离子模式下均取得了良好效果。木聚糖被选为半纤维素的代表性系统，因为它在植物基生物质中含量丰富。实验过程中使用了来自Carl Roth GmbH的商用桦木木聚糖，以及高纯度石墨粉（纯度99.9%，粒径5 μm）作为分析材料。实验中还使用了多种化学试剂，包括三乙胺（NEt?，纯度≥99.5%）、氯仿（CHCl?，纯度≥99.8%）、正己烷（纯度≥98%）、甲醇（MeOH，纯度99.9%）、三氟乙酸（TFA，纯度99.8%）、氨（NH?，浓度32%）等。这些试剂均按照其原始状态使用。

在实验过程中，为了提高分析的效率和准确性，采用了多种优化手段。对于液态分析，样本通过超声浴提取，使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，提取时间为15分钟，温度为30°C，样本浓度为10 g/L。在负离子模式下，样本悬浮液由100 μL提取液、100 μL 100 mM NH?溶液（溶剂为THF）、20 mg高纯度石墨粉和15 μL甘油组成。而在正离子模式下，样本悬浮液则由100 μL提取液、100 μL 10 mM NaTFA溶液（溶剂为甲醇）和30 mg石墨粉构成。

对于固态分析，样本与高纯度石墨粉以1:10（w/w）的比例混合，总固体质量为30 mg（负离子模式）或50 mg（正离子模式），并悬浮于50:50（v/v）的THF/DMSO溶液中，同时加入15 μL甘油。在正离子模式下，样本悬浮液使用的是20:80（v/v）的CHCl?/DMSO溶液，同时加入50 mM NH?TFA作为离子化辅助剂。所有悬浮液均经过10分钟的超声处理，随后在不锈钢MALDI靶上点样，并在40°C的干燥箱中干燥20分钟。

质谱分析使用的是Bruker Daltonics的15 T solariX FT-ICR-MS设备，该设备配备有电喷雾电离（ESI）和MALDI源。MALDI源使用的是Smart Beam II激光，其波长为355 nm，脉冲持续时间为3 ns，脉冲能量为500 μJ，峰值功率为170 kW，平均功率为1.5 W。所有分析均在分辨率为R = 800,000（在m/z 400时）进行，数据集大小为8 M。所有质谱数据均以三重复进行采集。关键的质谱参数根据方法开发结果进行了总结，详见表1。

#### 数据处理

数据处理一般遵循Sander等人提出的方法，但根据样本特性进行了相应的调整。对于GALDI-FT-ICR-MS数据集，使用了内部生成的校准列表进行校准。数据处理过程中，采用Bruker Daltonics的DataAnalysis 5.0（SR1）软件生成峰和分子式列表。分子式分配基于信号噪声比（S/N）≥10的峰，并且理论质量与实际质量之间的偏差不应超过0.3 ppm。元素组成限制为C?H?O?Na?，其中C的范围为0 ≤ a ≤ 100，H为0 ≤ h ≤ 200，O为0 ≤ o ≤ 100，Na为0 ≤ na ≤ 3（正离子模式）或na = 0（负离子模式）。进一步的数据处理使用MATLAB 2023b软件，结合内部脚本进行空白校正、分子式筛选（应用Herzsprung等的规则）、数据评估和绘图。

#### FT-IR光谱分析

红外光谱分析使用的是Nicolet iS10 FT-IR光谱仪，配备有衰减全反射（ATR）附件和金刚石棱镜（30,000至200 cm?1）。为了获得更详细的结构信息，光谱数据被用于验证质谱分析结果。样本以粉末形式直接应用于ATR单元，并通过压力塔进行压合。光谱范围为4,000至400 cm?1，扫描次数为32次，分辨率设置为4 cm?1。光谱的采集和处理使用Thermo Fisher Scientific的OMNIC软件（版本9.8.372）进行。

#### NMR光谱分析

13C固态核磁共振（NMR）分析使用的是400 MHz Bruker AVANCE III HD WB光谱仪，配备有4 mm交叉极化/魔角旋转（CP/MAS）探头。分析在100.67 MHz（13C）和400.3 MHz（1H）下进行，旋转速度为12.5 kHz，使用4 mm ZrO?旋转器。CP过程采用1 ms的接触时间和50%的1H通道斜坡。共收集了20,480次扫描，回收延迟为3秒，采集时间为35毫秒。光谱的采集、处理和分析均通过Bruker Biospin的Topspin软件（版本4.0.6和3.6.5）完成。

#### 结果与讨论

##### 方法开发：液态GALDI-FT-ICR-MS

质谱是用于多糖结构表征的常用方法，特别是用于半纤维素。为了对未经处理的半纤维素进行全面表征，需要开发新的分析和准备程序。木聚糖作为半纤维素的代表性系统，因其在植物基生物质中的高含量而被选为研究对象。本研究的起点是本研究团队之前开发的用于木质素分析的GALDI(-)-FT-ICR-MS方法。在方法开发过程中，除了光谱特征外，还考虑了峰数、总离子电流（TIC）或平均m/z值等参数。峰数描述了S/N比至少为5的信号数量。所有参数均基于空白校正后的数据集进行计算。需要注意的是，本节主要关注方法开发的关键步骤。如需了解所有方法开发步骤的全面概述，读者可参考附录S1。

本研究首先关注于液态分析方法的开发，以表征桦木木聚糖中的可溶性成分。因此，木聚糖样本通过超声浴进行提取。为了获得可靠的结果，该提取过程在提取溶剂（最佳：DMSO）、浓度（最佳：10 g/L）、时间和温度（最佳：15分钟和30°C）方面进行了优化。随后，对正负离子模式下的GALDI样本准备进行了优化。样本准备包括将高纯度石墨悬浮在木聚糖提取液中，并加入额外的溶剂（负离子模式：THF；正离子模式：MeOH）。根据本团队之前的研究（24-26,30），石墨的使用量对离子化过程至关重要，因此对这一参数进行了优化（负离子模式最佳：20 mg；正离子模式最佳：30 mg）。此外，还研究了离子化辅助剂的影响，以支持多糖样本的离子形成。结果显示，添加碱（最佳：NH?）对负离子模式下的多糖离子化具有支持作用，而添加有机盐（最佳：NaTFA）则有助于正离子模式下的多糖离子化。相应的辅助剂浓度（负离子模式最佳：50 mM；正离子模式最佳：5 mM）也进行了优化。此外，方法开发过程还表明，对于负离子模式，添加甘油有助于提高点样质量，而正离子模式中则不建议添加甘油，因为其与溶剂的混溶性存在问题。

方法开发的最后一步是优化质谱参数，最终确定负离子模式下的飞行时间（TOF）为1.3 ms，正离子模式下的TOF为0.9 ms。TOF描述的是离子从碰撞室射出到ICR室被捕获所需的时间。因此，TOF值的差异影响了m/z值的覆盖范围，负离子模式下覆盖范围更大（固态：200至2,200；液态：200至2,000），而正离子模式下覆盖范围较小（固态：200至1,800；液态：200至1,700）。这表明，在正离子模式下，离子的m/z值更倾向于较低的值，而在负离子模式下则更倾向于较高的值。

##### 方法开发：固态GALDI-FT-ICR-MS

为了进一步简化准备流程，研究还探讨了是否可以省略提取步骤，从而能够表征不可溶的木聚糖寡聚物。因此，粉末样本直接与高纯度石墨混合，并悬浮于溶剂混合物中。对于固态分析，样本与石墨的比例（S/G比）对离子化过程具有重要作用，因此在方法开发过程中对该参数进行了优化。结果表明，1:10（w/w）的S/G比是适用于正负离子模式的最佳比例，总固体质量为30 mg（负离子模式）或50 mg（正离子模式）。

为了实现固态与液态方法之间的良好可比性，尝试使用与液态分析相同的溶剂混合物。对于负离子模式，成功使用了DMSO/THF（50:50 v/v）作为溶剂。对于正离子模式，为了确保良好的点样质量，使用了CHCl?/DMSO（20:80 v/v）的混合物。为了进一步提高点样质量，负离子模式下推荐添加甘油，而正离子模式下则不建议添加甘油，因为其与溶剂的混溶性存在问题。

方法开发的其余步骤与液态分析类似，包括离子化辅助剂（负离子模式最佳：NH?；正离子模式最佳：NH?TFA）及其浓度（负离子模式最佳：5 mM；正离子模式最佳：50 mM）的优化，以及TOF的设置（负离子模式最佳：1.4 ms；正离子模式最佳：1.2 ms）。更详细的开发过程概述见附录S1。

##### 方法比较

为了比较所开发的分析方法在固态和液态下的表现，使用了512次扫描进行分析。空白校正后的平均质谱图见图1，而峰数和平均m/z值的比较见图2。质谱图显示，在正离子模式下，样本信号覆盖的m/z范围较小（固态：200至1,800；液态：200至1,700），而在负离子模式下，覆盖范围更大（固态：200至2,200；液态：200至2,000）。这主要是由于正离子模式下的TOF值较小（见表1）。结果表明，在负离子模式下，样本的m/z值范围更大，而在正离子模式下则更小。此外，固态分析的m/z范围略大于液态分析。这与质谱图中信号分布的差异相一致，表明在负离子模式下，较长的寡聚物在分析中更为常见，而在正离子模式下则主要为较短的寡聚物。这些结果表明，在负离子模式下，固态和液态分析方法在结构特征上表现出一定的相似性，而正离子模式下的分析方法则显示出较高的信号强度，这可能与多糖倾向于形成正电荷加合物（如[Na+M]?）有关，而不是通过去质子化形成负电荷离子（如[M–H]?）。

为了评估方法的可重复性，计算了峰数和平均m/z值的相对标准偏差（RSD）。如表2所示，单次准备的RSD值均低于10%，且在所有四种方法中表现相似。这表明所开发的准备和分析方法在样本间的重复性方面具有良好的一致性。此外，三份独立样本的RSD值也显示出积极的结果，表明这些方法在重复分析中的稳定性。值得注意的是，负离子模式下的峰数RSD值较高，这可能与人为因素有关，而这些因素在三次独立准备中对分析结果的影响更为显著。此外，样本系统的复杂性也导致了离子化效率较低，从而增加了分析结果的波动性。总体而言，RSD值均未超过15%，表明这些方法在样本分析中具有较高的可重复性。

##### 分子式统计评估

为了更深入地理解数据，对空白校正后的平均分子式列表进行了分析，同时结合峰列表评估。首先，研究了不同方法之间的相似性。图3展示了一个相关矩阵，其中包含了四种方法的相对峰强度之间的相关性。结果显示，正负离子模式下，固态和液态分析方法之间的相关性较高（ρ_pos = 0.80，ρ_neg = 0.82），而正负离子模式之间的相关性较低。这表明，在相同的离子模式下，固态和液态分析方法在分子式识别上具有较高的相似性，而正负离子模式之间的差异则更为显著。此外，分子式分布的差异也表明，正离子模式下，分子式更倾向于较低的氧含量，而负离子模式下则更倾向于较高的氧含量。

##### 结构信息分析

为了进一步揭示木聚糖寡聚物的结构，使用了RKM-m/z图。RKM是基于Kendrick质量缺陷的计算方法，用于比较分子式的质量偏差。对于正负离子模式，样本的RKM值呈现出不同的分布模式，表明其结构特征存在差异。图6展示了正负离子模式下的RKM-m/z图，以及对应的质谱图。图中显示，不同RKM值对应的信号可能代表结构不同的寡聚物。例如，[X_n]、[X_n?H?O]、[X_nAc]、[X_n(MeGlcA)?H?O]和[X_n(MeGlcA)]等分子式系列，均显示出不同的信号强度，表明它们在结构上存在显著差异。这些信号强度的变化进一步支持了分子式识别的多样性。

此外，对正负离子模式下的信号强度进行了比较。结果显示，正离子模式下的信号强度整体较高，这可能与多糖倾向于形成正电荷加合物有关。然而，这一现象并非适用于所有信号。例如，在图6c和d中，未取代的系列（[X_n]和[X_n?H?O]）在正离子模式下信号强度显著增加，而酸性取代的系列（[X_n(MeGlcA)]和[X_n(MeGlcA)?H?O]）则显示出较低的信号强度。相比之下，乙酰化系列（[X_nAc]）对离子模式的变化不敏感，表明其结构较为稳定。这些观察结果表明，离子化效率不仅取决于离子模式，还受到分析分子结构的影响。因此，建议在对木聚糖进行结构表征时，同时使用正负离子模式。

##### IR和NMR分析

为了验证质谱分析结果，进行了红外（IR）和固态核磁共振（NMR）分析。这些数据有助于评估质谱结果的准确性，并支持木聚糖的结构表征。IR光谱（图7）显示了多糖的特征吸收带，包括羟基（ν(O–H)）在3,342.17 cm?1的伸缩振动、C–H伸缩振动在2,871.61 cm?1以及C?–H变形振动在894.85 cm?1，后者通常与β-1,4-糖苷键相关。此外，图7中还显示了与4-O-甲基葡萄糖醛酸相关的酸性取代带，包括不对称和对称的COO?伸缩振动在1,602.62 cm?1和1,417.48 cm?1，以及1,750至1,700 cm?1的ν(C=O)振动（在酸或酯中），以及1,247.77 cm?1的ν(C–O)振动（在酸中）。这些结果支持了木聚糖主链存在酸性取代（如4-O-甲基葡萄糖醛酸）和部分乙酰化（常见于双子叶植物，如桦木）的假设。

此外，图8展示了13C-CP/MAS NMR光谱，该光谱显示了木糖单体的五个环碳原子的信号（C?至C?），其中C?的化学位移为102.5 ppm，C?为82.4 ppm，C?为75.0 ppm，C?为73.6 ppm，C?为63.9 ppm。这些信号的分配基于Dinand等人的研究。此外，图8中182.0至167.0 ppm范围内的宽信号可能与MeGlcA的C=O基团（在羧基中）或乙酰基的酯基团相关。此外，58.7 ppm和18.8 ppm处的信号可能对应于甲氧基和甲基基团，前者可能与MeGlcA的甲氧基相关，后者可能与木聚糖主链上的乙酰基相关。由于该信号的强度较低，可以推测乙酰化程度较低，可能低于5%。然而，需要注意的是，NMR光谱并不能提供定量数据，因此该估计仅为近似值。

尽管多种分析方法的结果相互一致，但NMR和IR光谱与质谱数据之间仍存在一定的差异。NMR和IR光谱中并未显示出其他化合物类别的存在，而质谱数据（见图5）则清晰地揭示了样本中存在其他化合物类别。这些化合物类别可能由于其在样本中的低浓度而未在NMR和IR光谱中被检测到，从而被覆盖在多糖振动中。这些化合物类别通常具有芳香性，因此在质谱分析中具有较高的可检测性，尽管其在样本中的浓度较低。

#### 结论

本研究旨在开发基于GALDI-FT-ICR-MS的分析方法，以表征桦木木聚糖的可溶性和不可溶性成分。通过正负离子模式的分析，成功识别了多种分子式系列，揭示了木聚糖的结构多样性。此外，IR和NMR分析结果与质谱数据一致，进一步支持了木聚糖的酸性取代和部分乙酰化特征。这些分析方法为木聚糖的结构表征提供了新的视角，有助于其在不同领域的应用。未来的研究可以将这些方法应用于其他来源的木聚糖或半纤维素样本，以进一步验证分析流程并展示其在不同样本系统中的适用性。这些方法的开发不仅提高了对木聚糖结构的理解，还为更高效的分离、纯化和衍生化过程提供了理论支持，有助于未来更广泛地利用木聚糖及其相关的半纤维素材料。