基于抗性基因的发现：一种真菌螺环酮酸酯作为乙酰乳酸合成酶抑制剂的应用

《Journal of the American Chemical Society》：Resistance Gene-Guided Discovery of a Fungal Spirotetramate as an Acetolactate Synthase Inhibitor

抗真菌和 herbicidal活性天然产物的基因组挖掘及新化合物发现。研究开发了一个基于耐药基因的真菌基因组挖掘工具FunBGCeX，通过分析2500余种真菌基因组，发现编码ALS同源物的次级代谢基因簇。实验鉴定到新型生物活性分子pterspiramide A（结构含spiro-tetramate和cis-decalin），证实其通过抑制ALS发挥抗真菌和 herbicidal作用，并解析了其生物合成途径及立体化学。

　　生物活性天然产物的发现一直是药物研发和功能分子研究的重要领域。这些天然产物因其广泛的生物活性和独特的分子结构而备受关注。近年来，随着微生物基因组测序技术的不断进步，基因组挖掘成为一种高效识别和表征这些生物活性分子的方法。然而，许多天然产物的生物活性可能与其生产者自身存在矛盾，因为这些化合物可能对产生它们的微生物有毒性。因此，为了防止自身受到其代谢产物的伤害，微生物往往进化出自我抗性机制。这种机制通常表现为基因组中编码抗性蛋白的基因簇，这些抗性蛋白能够抵抗其自身的代谢产物，从而确保细胞功能的正常运行。本研究通过开发一种基于抗性基因的基因组挖掘工具，成功发现了新的生物活性天然产物——pterrespiramide A（化合物1），该化合物不仅具有独特的分子结构，还表现出明确的抗真菌和除草活性。

本研究的核心在于利用抗性基因作为“钩子”，引导基因组挖掘，从而识别出可能编码生物活性天然产物的基因簇。通过这种方法，科学家可以将注意力集中在那些可能具有重要生物功能的基因簇上，而不仅仅是随机筛选。这一策略在过去的十年中已被广泛应用，特别是在真菌基因组挖掘领域。然而，该方法的一个主要局限是，许多挖掘出的基因簇可能编码已知的化合物，从而导致重复发现的问题。为了解决这一问题，本研究更新了已有的基因组挖掘工具FunBGCeX，使其能够更有效地识别潜在的抗性基因，并挖掘出具有新生物活性的化合物。

在本研究中，研究人员将注意力集中在编码丙二酰辅酶A合成酶（ALS）同源蛋白的基因簇上。ALS是一种在微生物和植物中广泛存在的关键酶，负责支链氨基酸的合成。许多已知的抗微生物和除草剂化合物都以ALS为作用靶点。因此，若某一基因簇中存在ALS同源蛋白，可能意味着该基因簇编码的天然产物具有与ALS相关的生物活性。研究人员利用FunBGCeX工具，对2544个Pezizomycotina真菌的参考基因组进行了全面分析，并从中筛选出一系列可能含有抗性基因的基因簇。其中，一个被标记为“pts”基因簇的簇引起了研究人员的特别关注。该基因簇编码了一种ALS同源蛋白，并且其结构和功能与其他已知的ALS抑制剂基因簇有所不同，表明它可能具有新的生物活性。

为了验证这一假设，研究人员进行了异源表达实验，将“pts”基因簇中的相关基因转入易于培养的Aspergillus oryzae菌株中，并利用高效液相色谱（HPLC）和核磁共振（NMR）技术对代谢产物进行了鉴定和结构分析。实验结果显示，该基因簇能够产生一种名为pterrespiramide A的化合物（化合物1），其分子结构包括独特的螺旋四胺（spirotetramate）和顺式十氢化萘（cis-decalin）单元。进一步的生物活性测试表明，化合物1能够有效抑制酵母菌株中的ALS活性，并表现出显著的抗真菌和除草活性。这一发现不仅验证了“pts”基因簇的功能，还揭示了基于抗性基因的基因组挖掘策略在发现新型生物活性分子方面的巨大潜力。

除了化合物1，研究人员还鉴定出其同分异构体——pterrespiramide B（化合物2），以及一系列中间代谢产物，包括pterramide（化合物3）和pterrespiramides C、D（化合物4和5）。这些化合物的结构和生物活性存在显著差异，表明它们可能在生物合成过程中经历了不同的化学转化。例如，化合物3在结构上与化合物1相似，但缺乏螺旋环和双键，而化合物4和5则在结构上与化合物1和2类似，但含有羧基。通过进一步的实验分析，研究人员发现这些化合物之间的转化可能涉及非酶促反应或酶促反应，其中P450酶PtsF和CAR酶PtsG在这一过程中起到了关键作用。特别是PtsG，其催化反应不仅表现出与传统CAR酶不同的电子转移特性，还能够进行四电子还原，从而形成具有生物活性的化合物1。

此外，研究人员还发现，化合物1和化合物2的抗真菌活性存在差异，这可能与其立体化学构型有关。化合物1具有15R构型，而化合物2则为15S构型。这一构型差异对化合物的生物活性产生了显著影响，表明立体化学在天然产物功能中扮演着重要角色。通过进一步的实验，研究人员确定了化合物1的立体构型，并利用X射线晶体学技术确认了其完整的分子结构。这些结果不仅加深了对“pts”基因簇功能的理解，也为后续的天然产物研究提供了新的思路和方法。

在生物活性研究方面，研究人员通过酵母生长抑制实验和植物根系生长实验，验证了化合物1对ALS的抑制作用及其在抗真菌和除草方面的潜力。实验结果显示，化合物1能够显著抑制酵母菌株的生长，并对拟南芥幼苗的根系生长产生剂量依赖性的抑制效果。这一发现表明，化合物1可能是一种新型的ALS抑制剂，具有潜在的农业和医药应用价值。同时，研究人员还发现，尽管化合物3和化合物4、5在生物合成过程中具有重要作用，但它们的抗真菌活性较弱，这可能与其分子结构或立体构型有关。

基于这些研究结果，研究人员提出了一种可能的生物合成路径。该路径包括多个关键步骤，如PKS–NRPS酶PtsA和PtsE的协同作用、Diels–Alderase酶PtsC的环加成反应、P450酶PtsF的氧化反应以及CAR酶PtsG的还原反应。这些酶的协同作用不仅形成了化合物1的复杂分子结构，还确保了其生物活性的实现。特别是在PtsF和PtsG的催化过程中，研究人员发现了一些独特的化学机制，如P450酶的氧化环形成和CAR酶的四电子还原。这些机制的发现为理解天然产物的生物合成提供了新的视角，并可能为未来的药物开发和生物合成工程提供理论支持。

本研究不仅揭示了pterrespiramide A的分子结构和生物活性，还展示了基于抗性基因的基因组挖掘策略在发现新型生物活性分子方面的有效性。这一策略通过利用微生物自身的抗性基因作为线索，能够更精准地识别可能产生重要天然产物的基因簇。在本研究中，通过这一方法，研究人员成功发现了新的ALS抑制剂，并揭示了其独特的生物合成路径和分子结构。这些发现不仅拓展了我们对天然产物多样性的认识，还为开发新型抗真菌和除草剂提供了新的候选分子。

值得注意的是，尽管本研究主要关注了ALS相关的基因簇，但FunBGCeX工具的开发也为其他类型的抗性基因研究提供了可能。例如，该工具可以用于挖掘可能编码其他关键酶（如免疫抑制剂靶点蛋白）的基因簇，从而发现具有不同生物功能的天然产物。此外，研究人员还提到，虽然现有的基因组挖掘工具（如FunARTS）在某些情况下未能识别“pts”基因簇中的抗性基因，但结合FunBGCeX和FunARTS等工具，可能能够更全面地挖掘微生物基因组中的抗性基因，从而发现更多具有潜在应用价值的生物活性分子。

总之，本研究通过开发和优化基因组挖掘工具，结合异源表达和结构分析技术，成功发现了新的生物活性天然产物pterrespiramide A。这一发现不仅展示了基于抗性基因的基因组挖掘策略的有效性，还揭示了天然产物合成中的一些独特机制，如P450酶的氧化环形成和CAR酶的四电子还原。这些成果为未来的天然产物研究和药物开发提供了重要的理论基础和技术支持，同时也为微生物基因组的深入挖掘打开了新的大门。随着基因组测序和合成生物学技术的不断发展，类似的策略有望在更多生物活性分子的发现中发挥作用，推动天然产物研究向更高层次迈进。