用于神经退行性疾病中细胞死亡的新兴分子PET成像技术

《Journal of Medicinal Chemistry》：Emerging Molecular PET Imaging for Cell Death in Neurodegenerative Diseases

神经退行性疾病中神经元细胞死亡的PET探针研究进展，涵盖凋亡、坏死、铁死亡等机制，重点分析血脑屏障穿透性及靶向分子（如caspase、RIPK1、PARP1、PS、PE）的PET探针开发现状与临床转化挑战。

　　神经退行性疾病与神经元细胞死亡密切相关，而能够实时、准确地可视化这种细胞死亡过程对于疾病的早期诊断、监测病情进展、评估治疗效果以及开发新的治疗手段至关重要。正电子发射断层扫描（PET）作为一种非侵入性的成像工具，能够提供关于细胞死亡过程的定量信息，从而为理解神经退行性疾病的细胞死亡机制提供宝贵的视角。本文综述了近年来在神经退行性疾病中用于可视化细胞死亡的PET探针，同时探讨了靶向与细胞死亡相关机制的新兴探针，并分析了PET探针在临床应用中的发展与挑战。

### 1. 引言

神经退行性疾病通常表现为神经元功能的进行性退化，这一过程由突触和轴突的退化驱动，最终导致神经元死亡。这类疾病包括阿尔茨海默病（AD）、额颞叶变性（FTLD）、路易体痴呆（LBD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、亨廷顿病（HD）以及库鲁病（CJD）等。这些疾病在全球范围内影响着数以百万计的人群，导致认知和运动功能的逐渐丧失，从而显著降低患者的生活质量，并对社会经济造成沉重负担。目前，大多数神经退行性疾病尚无有效的治疗手段，无法有效延缓其进展。

神经元细胞死亡是这些疾病发生发展的关键因素，异常的神经元死亡机制在多种神经退行性疾病中都有涉及。传统上，凋亡和坏死被认为是神经元死亡的主要途径。然而，越来越多的证据表明，其他死亡机制，如铁死亡、自噬、旁旁死亡、炎性坏死以及旁坦诺斯等，也在其中发挥重要作用。因此，对神经退行性疾病患者进行神经元死亡的监测，并识别其具体机制，对于医生制定合适的治疗策略、选择适当的细胞死亡抑制剂以及及时调整治疗方案具有重要意义。这不仅有助于延缓或阻止细胞死亡，还能在疾病早期进行干预，从而降低医疗成本并改善预后。

PET技术作为一项强大的成像工具，能够提供关于细胞死亡机制的分子层面信息。不同的细胞死亡途径具有独特的形态学特征和信号机制，为开发靶向特定生物标志物或生化过程的PET探针提供了可能性。例如，凋亡相关的分子标志物包括半乳糖苷酶（caspases）、受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、聚ADP-核糖聚合酶（PARP）、磷脂酰丝氨酸（PS）以及磷脂酰乙醇胺（PE）。一些PET探针已经进入临床应用，如用于凋亡膜印记成像的[¹⁸F]ML-10。然而，这些探针多用于肿瘤领域，其在神经退行性疾病中的应用相对有限。其中一个主要障碍是血脑屏障（BBB），它限制了许多成像剂进入中枢神经系统（CNS）。例如，在一项II期临床试验中，[¹⁸F]ML-10成功地在急性缺血性中风患者的脑梗死区域显示出凋亡细胞死亡的影像，但其在完整BBB区域的渗透能力有限，只能在磁共振成像（MRI）显示对比增强的区域进行摄取。

因此，本文总结了过去十年中用于监测神经元死亡的PET探针，并包括了一些针对肿瘤中细胞死亡相关分子的探针，这些探针具备穿透BBB的能力。鉴于不同细胞死亡途径之间存在复杂的相互作用，本文将PET探针按其针对的细胞死亡生物标志物进行介绍，而非仅仅基于特定的细胞死亡机制。此外，本文还将讨论这些探针的放射合成、药理学特性、体内验证以及在开发过程中遇到的挑战。

### 2. 神经退行性疾病中的细胞死亡途径

在神经退行性疾病中，多种细胞死亡机制被观察到，包括外源性凋亡、内源性凋亡、坏死性凋亡（necroptosis）、旁坦诺斯（parthanatos）、铁死亡（ferroptosis）、炎性坏死（pyroptosis）、细胞肿胀（oncosis）、溶酶体、自噬、吞噬以及线粒体通道（mitoPore）等。尽管每种细胞死亡途径都伴随着特定的生理变化，但它们在许多特征上存在重叠，这使得区分不同死亡机制变得困难。

凋亡是细胞死亡的经典表现形式，其特征包括Bcl-2家族蛋白的表达变化、caspase的激活、DNA的断裂以及PS的外化。然而，这些分子标志物在其他死亡途径中同样存在，例如Bcl-2家族蛋白也参与调控自噬，而caspase的激活在炎性坏死和某些类型的坏死中也可见。因此，传统的PET探针可能缺乏足够的特异性来区分不同的细胞死亡机制。这种不确定性可能影响疾病的诊断以及靶向治疗策略的选择，比如选择适当的细胞死亡抑制剂。为了解决这一问题，研究人员正在开发针对特定细胞死亡机制的关键分子标志物的放射探针，以提高其特异性。

本文将对与神经退行性疾病相关的几种主要细胞死亡途径及其对应的PET探针进行简要介绍，并进一步讨论这些探针的靶向机制。

### 3. 用于脑部细胞死亡成像的PET探针

#### 3.1 靶向caspase的PET探针

caspase是一类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，参与多种细胞死亡机制，包括外源性凋亡、内源性凋亡以及炎性坏死。外源性凋亡由死亡受体的激活触发，随后激活关键的启动caspase，如caspase-8。内源性凋亡通常由细胞应激引发，导致线粒体释放细胞色素，进而激活启动caspase-9。这两种机制最终会融合，激活执行caspase，如caspase-3和caspase-7。因此，caspase-3和caspase-7被认为是有潜力的PET探针靶点。

isatin磺胺类化合物是目前研究最为广泛的caspase靶向放射探针。这些探针对caspase-3/7表现出高亲和力，这是由于它们能够通过isatin环的3-羰基基团与caspase活性位点的半胱氨酸残基（Cys163）形成可逆的共价键。Sobrio及其团队报道了一系列isatin化合物[¹⁸F]1-3，这些探针具有更高的caspase-3/7亲和力和体内稳定性。这些探针可以通过自动化GE TracerLab FX-FN模块进行核苷酸取代反应合成，其中氟-18通过取代isatin前体中的磺酸离去基团引入。该探针具有高放射化学纯度（>98%）和高比活度（220–270 GBq/μmol）。对于这些isatin PET探针，caspase-3的IC₅₀值分别为8.4、8.1和13.7 nM，caspase-7的IC₅₀值分别为4.6、5.4和9.6 nM。在大鼠中风模型中，这些探针能够有效检测凋亡过程。通过暂时性中动脉闭塞（MCAO）诱导的中风模型，凋亡相关的caspase-3表达在缺血后24小时达到峰值。因此，研究人员在诱导中风后24小时对这些探针进行了体内PET成像。初始的PET成像在标准分辨率下显示了脑部缺血和对侧（未受影响）区域的普遍弱摄取。为了进一步研究，研究人员进行了微PET（μPET）成像，这种技术在小动物研究中提供了更高的空间分辨率和灵敏度。值得注意的是，在20至45分钟内，[¹⁸F]2在缺血和对侧区域显示出显著的摄取差异，而在45分钟后，[¹⁸F]1显示出类似的摄取差异。在感兴趣区域（ROI）的摄取比值在90分钟时达到1.52（对于[¹⁸F]1）和62分钟时达到1.26（对于[¹⁸F]2）。相比之下，[¹⁸F]3和参考探针[¹⁸F]ML-10没有显示出明显的摄取差异。

Bartha团队开发了一种双模态PET/荧光探针[⁶⁸Ga]Ga-TC3-OGDOTA，该探针能够在体外和体内检测活跃的caspase-3。如图2A所示，这种双模态探针通过两步合成制备。首先，一个caspase可裂解的肽被标记为荧光染料Oregon Green，通过其半胱氨酸侧链的亲核取代反应。第二步，该肽通过DOTA部分与[⁶⁸Ga]GaCl₃配位，从而得到最终的PET探针。在神经模型中，包括中风（MCAO大鼠）和AD（5xFAD小鼠）模型中，该探针被用于研究其体内PET成像效果。5xFAD模型显示，小鼠在8-9个月时表现出明显的神经退行性和caspase-3活性。因此，研究人员在8个月以上的小鼠中进行PET成像研究。[⁶⁸Ga]Ga-TC3-OGDOTA在这些模型中显示出脑部摄取。然而，由于其在小鼠组织中的分布分辨率较低，无法区分特定的脑部结构，因此采用了一种简化的ROI分配方法。例如，在5xFAD模型中，PET动力学分析表明该探针在前脑区域有更高的摄取，这一结果在通过后脑作为参考区域的Patlak K_i常数中得到了支持。摄取模式与Thioflavin S染色重叠，表明其在脑部淀粉样斑块周围有弥漫性定位。此外，[⁶⁸Ga]Ga-TC3-OGDOTA在体外和体内都能成功识别凋亡神经元。光学清除技术显示，该探针与脑细胞中的活跃caspase-3共定位（图2C中白色箭头所示）。

尽管caspase靶向探针的发展已经显著扩展了其在肿瘤学以外的应用潜力，但其在神经退行性疾病成像中的转化仍处于早期阶段。面临的挑战包括caspase激活水平有限、表达模式短暂以及非特异性结合等。因此，继续优化探针设计并在相关的神经退行性疾病模型中进行验证，对于实现其在CNS疾病中的诊断价值至关重要。

#### 3.2 靶向RIPK1的PET探针

RIPK1是一种含有死亡结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调控细胞死亡。通过肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）激活RIPK1可以触发外源性凋亡或坏死性凋亡。RIPK1依赖的细胞死亡与多种神经退行性疾病有关，如ALS、FTLD和AD。RIPK1结构中具有一个独特的疏水口袋，这使其成为药理学抑制的理想靶点。因此，PET探针的开发利用了现有的RIPK1抑制剂。然而，一些研究在脑部渗透性或非特异性结合方面遇到了挑战。例如，尽管[¹¹C]PK68显示出作为RIPK1靶向PET探针的潜力，但它难以有效穿透脑部。另一个探针[¹¹C]GG502虽然表现出对RIPK1的特异性结合和良好的脑部渗透性，但其在体内的代谢速度较快，导致非特异性结合信号。

Zhang及其团队开发了一种RIPK1靶向的PET探针[¹⁸F]CNY-07（K_d = 68 nM），通过铜介导的[¹⁸F]氟化反应制备，基于一种小分子RIPK1抑制剂5-((1H-吲哚-3-基)甲基)-3-甲基-2-硫代咪唑并[4,5-b]吡咯烷-4-酮（Nec-1）及其类似物Nec-1s。[¹⁸F]CNY-07在放射化学产率（RCY）方面表现出良好性能（23–28%，非衰变校正的陷阱[¹⁸F]氟化物），具有高放射化学纯度（>95%）和高比活度（1.766 ± 0.2 Ci/μmol）。在小鼠体内的PET成像显示，[¹⁸F]CNY-07能够有效穿透BBB，达到最大脑部摄取（%ID/cc）为3，且在体内的代谢稳定性良好。尽管[¹⁸F]CNY-07对RIPK1表现出相对较高的亲和力，但其脑部摄取似乎反映的是有限的体内结合特异性，而非RIPK1特异性结合，这在自阻断实验中得到了体现，仅表现出30%的脑部摄取减少。此外，[¹⁸F]CNY-07的清除速度较慢，其在脑部的放射性在60分钟时仍维持在约3%ID/cc，这可能影响其在神经退行性疾病中的转化潜力。

为了解决[¹¹C]CNY-07的清除问题，Bai及其团队开发了一种第二代分子[¹¹C]CNY-10（也称为[¹¹C]Nec-1s）。该探针通过一步的N-甲基化反应合成，使用[¹¹C]甲基碘。该探针在放射化学纯度（>95%）和摩尔活性（305 GBq μmol^–1）方面表现出色。与[¹⁸F]CNY-07相比，[¹¹C]CNY-10在野生型小鼠中表现出更高的脑部摄取（SUV_max: 0.8 vs 0.6）和更快的清除动力学，其在60分钟时的脑部放射性从0.8 SUV降至0.3 SUV。在非人灵长类动物（NHP）中，[¹¹C]CNY-10也表现出良好的脑部摄取和异质分布。此外，8个月大的5xFAD小鼠被用于研究其在AD小鼠中的表现。在5xFAD小鼠模型中，[¹¹C]CNY-10显示出有希望的神经退行性疾病相关变化，其在5xFAD小鼠脑部的所有ROI中表现出比野生型小鼠更高的摄取（图5B）。值得注意的是，AD小鼠脑部的RIPK表达也显著增加。因此，[¹¹C]CNY-10被认为是RIPK1靶向PET配体的有价值的候选者，值得进一步的转化研究。

#### 3.3 靶向磷脂酰丝氨酸（PS）的PET探针

PS是一种带负电荷的磷脂，正常生理条件下主要位于细胞膜的内层，由ATP依赖的翻转酶维持。PS外化是凋亡的标志性特征，已被广泛研究用于外周疾病，如肿瘤和心血管损伤。然而，在神经退行性疾病背景下，PS的暴露更为复杂。神经元凋亡往往是不完全或失调的，其特征可能与其他细胞死亡机制重叠，如坏死性凋亡和铁死亡。尽管如此，PS仍是一个有潜力的成像靶点，因为它在凋亡信号中出现较早，并且在细胞膜上具有较高的可接近性。PS的暴露在AD和ALS患者的尸检样本中被观察到，尤其是在微胶质细胞激活明显的区域，这表明PS靶向探针可能能够捕捉到神经退行性疾病早期的神经元应激反应。

Annexin V是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高亲和力（K_d约为10 nM）。利用这种强而特异的相互作用，荧光标记和放射标记的Annexin V及其衍生物已被广泛用于凋亡的预临床和临床评估。放射标记的Annexin V肽代表了第一代用于体内成像的探针，能够检测凋亡和坏死过程。然而，这些探针在神经退行性疾病中的应用受到其分子量（约36 kDa）的限制，这阻碍了它们穿透BBB的能力，从而无法有效成像CNS中的神经元死亡。

Smith及其团队开发了一种小分子、荧光标记的锌（Zn²⁺）-2,2’-二吡咯烷（DPA）复合物，作为Annexin V的仿生替代物。该探针在体外凋亡成像中表现出更快的结合动力学、更小的分子量以及对钙浓度的依赖性较低。这种探针不仅在体外具有高亲和力，而且在体内表现出良好的渗透性和稳定性。Wang的团队进一步发展了该探针用于PET成像，开发了[¹⁸F]FP-DPAZn2。该探针通过改良的PET-MF-2 V-IT-I方法合成，利用[¹⁸F]氟化物标记前体，其放射化学产率（RCY）为35 ± 5%（n = 10），放射化学纯度（>95%）和比活度（4.0 GBq/μmol）均较高。在正常大鼠中，该探针表现出适度的脑部摄取（1.12 ± 0.18% ID/g在30分钟时）。在7个月大的AD小鼠模型中，[¹⁸F]FP-DPAZn2在脑部表现出明显的摄取增加，其在AD模型小鼠中的摄取比值在18分钟时达到1.35，60分钟时达到1.88。然而，该探针的脑部摄取仍然较为有限，这表明其在神经退行性疾病中的应用仍需进一步的结构优化，如增加脂溶性或引入转运剂。这些改进将有助于提高其在CNS成像中的适用性。

### 4. 从肿瘤学中获得的启示：具备BBB穿透能力的细胞死亡靶向PET探针

尽管针对神经退行性疾病中细胞死亡的PET探针仍然有限，但肿瘤学领域在这一方面取得了显著进展。一些探针能够有效穿透BBB，为神经退行性疾病成像提供了潜在的候选或灵感来源。本文将重点介绍一些肿瘤学中开发的PET探针，这些探针在神经退行性疾病中的应用可能具有重要价值。

#### 4.1 靶向caspase的PET探针

Mach及其团队基于之前的工作，开发了一种针对caspase-3的isatin类似物[¹⁸F]WC-4–35，该探针在小鼠中显示出2.20 ± 0.12% ID/g的脑部摄取，但其主要目的是研究癌症治疗中caspase-3的激活情况。该探针通过两步反应合成，其中包含对ditosylate前体的放射标记以及随后的酚前体反应。其放射化学纯度为99.9%，比活度为996 mCi/μmol。该探针在体外和体内均能有效反映caspase-3的激活情况，但其在神经退行性疾病模型中的应用仍受到BBB渗透性和信号特异性方面的限制。

#### 4.2 靶向PARP1的PET探针

PARP1是PARP家族中最丰富且研究最深入的成员，主要负责通过碱基切除修复途径修复单链DNA断裂。当细胞受到严重氧化或基因毒性应激时，PARP1会被过度激活，导致PAR聚合物的过量产生，这会消耗细胞的NAD⁺和ATP储备，最终导致细胞死亡。PARP1在这一过程中扮演了信号媒介的角色，其在细胞死亡后会迁移至线粒体，触发凋亡诱导因子（AIF）的释放，进而导致大规模的DNA断裂和染色质凝聚，而这一过程与caspase无关。因此，PARP1在细胞死亡中的双重作用（修复与死亡）使其成为神经退行性疾病研究中的重要靶点。

Cai的团队报告了第一种能够穿透BBB的PARP1 PET配体[¹¹C]PyBic。该探针在RG2大鼠胶质瘤模型和健康非人灵长类动物（NHP）中进行了评估。其放射化学产率（RCY）为43 ± 10%（n = 8），放射化学纯度为>97%，比活度为148 ± 85 MBq/nmol。在RG2大鼠胶质瘤模型中，该探针在肿瘤组织中表现出特异性结合。PET成像显示其在NHP脑部具有良好的特异性结合，其在猴脑中的SUV值范围为0.5至1.5，这表明其具有良好的脑部渗透性。BP_ND值分析也显示其在猴脑中的最高摄取位于小脑，这与脑部PARP1的表达模式相似。在阻断条件下，BP_ND值显著降低，进一步验证了该探针在脑部成像中的潜力。这些结果表明，[¹¹C]PyBic在研究PARP1介导的旁坦诺斯在神经退行性疾病模型中的作用方面具有重要价值。

#### 4.3 靶向磷脂酰乙醇胺（PE）的PET探针

PE是另一种氨基酸磷脂，其在各种细胞应激和死亡过程中会发生重新分布。与PS不同，PE的外化更常与晚期凋亡或坏死事件相关，并可能在神经炎症中的膜重塑过程中上调。在多发性硬化症和创伤性脑损伤模型中，PE的暴露已被观察到在激活的微胶质细胞和退化的轴突中。这表明PE结合探针可能成为慢性神经退行性疾病的膜解体的一般性指标。

Duramycin是一种19个氨基酸的四环多肽，具有对PE的高亲和力和显著的特异性。它的结合机制涉及离子相互作用，特别是Duramycin的Asp15羧酸基团与PE头部的铵基之间的相互作用，以及Duramycin侧链与PE脂肪酰链之间的疏水相互作用。这些分子特性赋予了Duramycin优异的选择性和结合亲和力。此外，Duramycin在探针开发中还具有其他优势，如相对较小的分子量、对酶解的天然稳定性以及与多种同位素的易标记性。然而，目前的Duramycin基PET探针在BBB渗透性方面存在显著不足，这限制了它们在神经退行性疾病中的应用。因此，未来需要通过引入载体肽或受体介导的跨细胞转运策略，来增强Duramycin基探针的BBB渗透性，从而使其能够有效用于神经退行性疾病的成像。

### 5. 结论与展望

在过去十年中，用于成像脑部细胞死亡的PET探针取得了显著进展，特别是在针对凋亡和坏死性凋亡关键标志物如caspase和RIPK1的探针方面。Isatin磺胺类衍生物，如[¹⁸F]1-3和[¹⁸F]WC-4–35，表现出对caspase-3/7的高亲和力和选择性，但其在神经退行性疾病模型中的应用仍受限于BBB渗透性和信号特异性。同样，针对RIPK1的PET探针，如[¹⁸F]CNY-07、[¹¹C]CNY-10和[¹¹C]TZ7774，已经提供了有希望的体外和体内数据，特别是在神经炎症和神经退行性模型中。然而，进一步的优化工作，包括提高结合特异性、改善药代动力学和增强转化能力，仍然是必要的。

尽管大多数本文中提到的探针最初是在肿瘤学领域开发的，但随着对细胞死亡途径在神经退行性疾病中作用的认识不断加深，这些探针正在被重新利用或改进以适应脑部成像的需求。新兴的双模态探针，如[⁶⁸Ga]Ga-TC3-OGDOTA，展示了多模态方法在克服PET自身局限性方面的潜力，能够提供互补的空间和分子信息。

值得注意的是，一些细胞死亡靶向的PET探针已经进入临床评估阶段，这突显了它们在临床转化中的前景。例如，凋亡探针[¹⁸F]ML-10在中风患者的脑梗死区域显示出摄取，但其应用仅限于BBB受损的区域。在肿瘤学中，针对PARP的PET探针，如[¹⁸F]FTT、[¹⁸F]PARPi和[¹¹C]PyBic，在肿瘤成像中表现出良好的肿瘤-背景比。最近，[¹⁸F]AZD9574，这是一种来源于临床验证的PARP抑制剂的PET探针，在早期的人体成像研究中显示出良好的脑部渗透性和靶向结合能力，这表明其在神经疾病中的应用潜力。

展望未来，仍然存在几个关键挑战。首先，神经退行性疾病的异质性和动态性要求探针具有高靶向特异性、良好的BBB渗透性以及有利的药代动力学特性。其次，平衡代谢稳定性和快速清除非特异性信号对于最大化影像对比度和诊断准确性至关重要。最后，随着对神经退行性疾病分子机制的理解不断深入，新的靶点可能会不断涌现。

总之，尽管在脑部细胞死亡成像的PET探针开发方面取得了显著进展，但仍有大量机会来优化现有探针，探索新的分子靶点，如双重亮氨酸 zipper 激酶（DLK），并拓展其临床应用。化学、分子生物学和成像技术的结合，正为神经退行性疾病的诊断和治疗提供新的可能性。随着对调控细胞死亡途径如铁死亡和PANoptosis的理解不断加深，针对这些机制的分子靶点的探索可能会揭示下一代神经成像策略。