综述：酵母的米达斯之触——酵母利用甲醇增值的最新进展

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Yeast Midas’ touch: recent advances in the valorisation of methanol by yeasts

本综述系统阐述了甲基营养酵母（Methylotrophic yeast）利用甲醇（CH3OH）作为唯一碳源和能源的生理代谢机制（如甲醇利用途径MUT pathway、木酮糖单磷酸XuMP cycle）及其在生物制造中的最新应用。重点探讨了通过代谢工程改造奥戈塔酵母（Ogataea）和科马嘎塔ella（Komagataella）等菌株，将绿色甲醇（由CO2和可再生H2合成）高效转化为有机酸（如乳酸、3-羟基丙酸3-HP）、脂肪酸醇等高值化学品，为实现“无土地（land-free）”生物技术和可持续生物经济提供了前沿视角。

　　

引言：展望“无土地”生物技术革命

传统上，酵母发酵以糖类作为碳源和能源，主导着食品和生物燃料的生产。然而，用于糖生产的土地利用问题，是微生物生物技术未来面临的核心挑战。随着化学工业去化石燃料化的绝对需求，微生物生物技术的使用将大幅增加。在此背景下，甲醇作为一种替代性底物重新获得了关注。甲醇可以由生物质或使用绿色H₂通过CO₂加氢合成，从而有望实现“无土地”生物技术，并成为闭合碳循环的有效方式。

甲醇：成熟的构建模块和大宗商品

甲醇（CH₃OH）是最简单的醇，是化学工业的基础构建模块。近年来，甲醇作为生物过程的原料引起了兴趣。作为一种还原性C1分子，其氧化态低于葡萄糖或蔗糖，因此每分子具有更高的能量密度，可以被微生物用作能源和碳源。这种利用甲醇的能力，即甲基营养（Methylotrophy），在细菌中早已为人所知并得到研究。酵母物种中的甲醇代谢则是在20世纪60年代末期，同步于石油繁荣时期被首次描述。

新旧原料之争：甲醇与“无土地”革命

自20世纪70年代其从甲烷合成变得廉价以来，甲醇一直被视为理想的发酵底物。由于同期天然气价格上涨，工业界将焦点转向了其他底物，如糖基原料。然而，将这些原料用于非食品目的（例如生物燃料或化学品生产）带来了伦理困境，而与大规模土地使用相关的生物多样性丧失是另一个副作用。因此，工业界的兴趣部分转向了第二代（2G）原料，主要以木质纤维素生物质为代表。尽管不与食品领域竞争，但第二代原料存在不可忽视的缺点。由于其异质组成，木质纤维素生物质加工耗时且耗能。物流极具挑战性，需要新的、高度发达的基础设施。此外，异质组成增加了加工成本，因为不可发酵的残留物必须在发酵过程的上游或下游被去除。

第三代（3G）原料有望降低加工成本、保护土地、水和生物多样性，并应对温室气体排放。这些原料的代表是捕获的二氧化碳（CO₂）结合使用可再生能源，如风力和光伏发电产生的电力。大气中的CO₂是一种丰富的原料。因此，从发电厂流、工业流或大气中捕获碳是一项重要方法，其技术成熟，能同时解决两个主要问题：替代原料的供应和温室气体排放。捕获的碳有两种去向：它可以用作3G原料来生产商品，或者可以储存在地质汇中供未来使用。综合来看，这项技术被称为碳捕获、利用与封存。

尽管技术显著进步，但绿色甲醇的工业化生产在与经济燃料衍生的甲醇竞争方面仍不具备优势，并存在局限性。具体而言，工业化的瓶颈在于：昂贵且复杂的无碳H₂供应、低过程生产率和选择性以及催化剂性能限制。绿色甲醇的生产成本中，氢气占比高达70%，这种成本差异是竞争力方面最关键的障碍。此外，大规模部署需要大量的可再生电力输入。传统的铜锌氧化物催化剂在标准反应条件下，通常甲醇选择性为30-70%，CO₂转化率低于30%。为了解决这些限制，开发了新的催化剂配方，如铜-锌-铝氧化物和铟基材料，在选择性方面有所改善，但甲醇产率未变。在工厂规模上，生产率通常为0.1-0.5克甲醇/克催化剂·小时，只有少数催化剂能达到1.0克/克催化剂·小时。总的来说，这三个瓶颈限制了绿色甲醇生产的可扩展性和经济可行性。尽管如此，绿色甲醇的生产有望为“无土地” scenario铺平道路，这是我们旨在在本综述中引入的一个术语。将商品生产与替代原料的使用相结合，将缓解食品和饲料的土地短缺问题，同时应对温室气体排放。此外，“无土地”方法将在资源保护意识日益增强的时代促进可持续发展和环境管理。

甲醇代谢与调控

作为一种低分子量醇，甲醇对微生物细胞存在毒性问题，例如通过改变细胞膜的流动性和干扰细胞内蛋白质的稳定性。在细胞内，它也可以被酶促转化为如甲醛或甲酸等化合物，这些物质也对细胞生理具有毒性。甲酸在某些酵母和细菌物种中抑制电子传递链的细胞色素c氧化酶，导致酸碱平衡失调，使细胞陷入氧化应激并最终导致凋亡。甲醛通过进行蛋白质和DNA交联，对细胞表现出更强的毒性，这会导致DNA复制受损、蛋白质翻译受损和蛋白质活性降低，使细胞进入应激反应并最终导致细胞死亡。

一些微生物能够克服其固有毒性来代谢甲醇，这就是甲基营养的例子。甲基营养包括一系列代谢途径，通过这些途径，微生物利用高度还原的C1化合物（如甲烷或甲醇）来获取能量或将碳分子引入其分解代谢。细菌物种可以通过不同的代谢途径利用许多这类化合物，并拥有更多的合成模块来提高其同化的能量效率。关于甲醇，不同途径的组合，如核酮糖单磷酸途径或还原性甘氨酸途径，以及工程化的辅因子系统，如NAD或醌依赖性系统，使得甲醇同化得以优化，其中还原力得以保存并更好地用于细胞能量学。然而，甲基营养细菌对同化过程中产生的有毒中间体的耐受性较低，并且由于其快速生长而释放大量热量，这两个特性在生物过程中通常是不受欢迎的。相反，甲基营养酵母只能通过涉及木酮糖单磷酸循环的天然过氧化物酶体定位的甲醇利用途径来处理甲醇。

该途径包括三个主要步骤：甲醇初始转化为甲醛，随后将其异化产生能量和CO₂，或通过C3中间体将其同化为细胞组分和进一步的代谢产物。初始转化为甲醛通常由醇氧化酶执行，不过研究发现，在某些物种中，一种多效性的醇脱氢酶在AOX缺失的情况下也能进行转化。AOX活性依赖于O₂作为电子受体，O₂被转化为高反应活性的过氧化氢（H₂O₂）。作为一种强氧化剂，过氧化氢可能通过蛋白质失活、膜破坏或DNA损伤对细胞稳态构成严重威胁。作为甲基营养酵母中应对这种氧化应激的高度专业化系统的一部分，AOX活性与过氧化氢酶一起定位在过氧化物酶体内，以将其H₂O₂副产物解毒为H₂O和O₂。这种定位通过在空间上耦合两个酶促反应，使得细胞内H₂O₂得以快速清除，从而最大限度地减少对关键生物分子和细胞器的损害。过氧化物酶体内减少氧化应激的第二种机制由谷胱甘肽依赖性过氧化物氧化还原酶Pmp20执行。该酶将氢过氧化物还原为其非活性形式，从而防止其氧化能力。缺乏Pmp20但表达CAT的突变酵母细胞表现出比CAT阴性突变体更强的生长缺陷；这强调了该酶在缓解氧化应激中的关键作用，并可能指向其在清除一般活性氧方面的潜在活性。另一个解毒步骤是针对甲醇和甲醛的非酶促半缩醛形成，其被具有甲基甲酸合酶活性的胞质醇脱氢酶氧化为甲酸甲酯。

产生的甲醛随后可以遵循一条异化途径，在胞质中被完全氧化为CO₂。它通过与还原型谷胱甘肽进行非酶促缩合离开过氧化物酶体，然后经过两个连续的脱氢反应生成甲酸盐和CO₂，同时产生两个NADH分子。甲基营养酵母中也存在一个用于再生还原型谷胱甘肽的胞质系统。通量平衡分析研究表明，喂给细胞的大部分甲醇被异化为CO₂，尤其是在蛋白质生产过程中，其中三羧酸循环的上调也已被研究。不同的生长速率和甲醇摄取速率，以及共饲策略也直接影响直接异化为CO₂的甲醇量，有时损失率上升到90%以上。这展示了甲基营养酵母在碳保存率方面的一个严重弱点，并强调需要为甲基营养酵母的每个生产应用仔细选择饲料、饲喂速率和培养条件。

相反，甲醇的同化途径涉及甲醛与木酮糖-5-磷酸通过二羟基丙酮合酶的活性进行缩合，生成一分子二羟基丙酮和一分子甘油醛-3-磷酸。DHA进一步被二羟基丙酮激酶磷酸化，消耗一分子ATP，生成二羟基丙酮-3-磷酸。这些C3分子构成了同化途径中其余反应的基础，涉及通过磷酸戊糖途径中的一系列重排反应。鲁布迈尔等人提出了通过PPP反应进行的三次甲醛缩合反应。这些反应的净收益是每三分子甲醛产生一个C3分子，同时消耗三分子ATP。这个C3分子随后可以遵循一条分支路径，通过糖酵解下游被进一步同化分解代谢，或者通过糖异生或PPP进行合成代谢。

与传统的认为这些重排通过PPP在胞质中发生的观点相反，鲁布迈尔等人表明，甲基营养酵母在基因组水平上对一些PPP酶存在重复，这些酶带有额外的C末端过氧化物酶体靶向信号。他们进一步证明这些酶在K. phaffi的过氧化物酶体制备物中富集，从而证明了在过氧化物酶体内存在一个独立的区室化XuMP循环途径，与PPP分开。虽然并非所有预测参与胞质PPP模型的酶都有过氧化物酶体同工型，但推测具有类似活性的其他酶可以补偿它们的缺失，例如DAS催化其他转酮醇酶反应，因为该酶已在体外实验中证明可以与其他生理底物起作用。

MUT途径的第一道调控是通过其在过氧化物酶体这一亚细胞区室中的定位实现的。过氧化物酶体缺陷型突变体在以甲醇为碳源培养时表现出严重的生长缺陷或完全无法生长，即使它们表达了甲醇代谢所需的功能活性酶版本。此外，在甲醇存在下会诱导过氧化物酶体生物发生，这通过甲基营养酵母细胞在甲醇上生长的电子透射显微镜图像中过氧化物酶体的高出现率得到证明。在多形奥戈塔酵母和K. phaffi上进行的转录组学研究也表明，在甲醇生长的细胞中，过氧化物酶体相关基因上调。这些基因编码过氧化物酶体生成蛋白，它们是负责过氧化物酶体生物合成、增殖和功能的蛋白质。有趣的是，这种PEX基因的上调存在功能差异，只有与甲醇同化途径相关的基因和蛋白质显示出与携带其他代谢功能（如脂肪酸β-氧化）的PEX基因相比表达增加。例如，PEX5（PTS1信号的受体）和含有PTS1的基因与甲醇代谢相关，并显示在甲醇生长的酵母细胞中富集，而与脂肪酸代谢相关的PTS2信号肽的对应受体PEX7则不然。除了甲醇代谢的激活，缓解氧化应激的机制也通过Yap1p在产生活性氧和醛类物质时进行转录调控，从而上调CAT、Pmp20以及谷胱甘肽回收系统部分酶的表达。

碳源的选择也调节MUT途径。在葡萄糖上生长时，过氧化物酶体酶显著下调，而在甲醇上生长则强烈诱导该途径。这已在多形奥戈塔酵母的转录组水平以及K. phaffi的转录组和蛋白质组水平上观察到。在甲醇生长的细胞中，AOX和DAS的酶水平升高，但DAS在诱导后表现出更快的表达，这一机制被认为是为了通过能够在AOX表达开始后立即实现甲醛的缩合，从而降低其毒性而进化出来的。除了甲醇诱导，这些基因在不同碳源上也经历不同的表达水平，其活性程度因酵母物种而异。碳源从葡萄糖到甲醇的转变已被广泛研究和描述。甲醇基因被葡萄糖抑制，即使在非常低的浓度下也是如此，这一机制归因于利用更有效碳源的进化优势。在葡萄糖耗尽或暴露于非可发酵底物如甘油后，甲醇同化基因的表达水平因物种而异：博伊丁假丝酵母和多形奥戈塔酵母分别显示约10%和80%的最大AOX活性，而K. phaffi在没有甲醇暴露的情况下不表现出基因的去抑制。甲醇特异性诱导的机制已被描述为通过物种特异性转录因子介导：博伊丁假丝酵母中的Trm1/2p和Hap复合物，多形奥戈塔酵母中的Mpp1p，K. phaffi中的Mxr1和Mit1。这些转录因子在两个水平上介导甲醇的诱导：首先是在葡萄糖耗尽时的去抑制水平，其次是甲醇的实际诱导水平。

甲基营养酵母生产非蛋白源产物的代谢工程前沿

生产大宗和精细化学品的传统化学路线大多成本效益高且可靠。然而，日益严格的温室气体排放法规，加上对污染、化石资源枯竭和市场波动的担忧，正在推动寻找替代方案。在此背景下，微生物细胞工厂是促进从线性经济向循环经济转变的有前景的平台。尽管微生物系统目前在与经济化学合成相比的经济竞争力方面面临挑战，但它们提供了若干优势，包括安全性、可扩展性和成熟的方法学。微生物生物制造发展的一个关键限制在于原料的可用性和成本。这推动了对能够利用非常规、低成本且可持续底物的微生物宿主的日益增长的兴趣。

甲基营养酵母，特别是奥戈塔酵母属、科马嘎塔ella属、库拉什酵母属和假丝酵母属，因其独特的代谢和工业上有利的特性而受到关注。这些生物能够以甲醇作为唯一碳源和能源生长。此外，它们具有耐低pH值和克雷布特里阴性表型，这防止了有毒副产物的积累。此外，它们表现出进行正确且兼容的翻译后修饰的能力，以及高效的分泌系统。最后，它们具有严格的基因调控和甲醇诱导型启动子的强诱导性。

奥戈塔酵母属

最近分类的奥戈塔酵母属，以前称为汉逊酵母属，包含许多以其在发酵和化学品生产中的作用而闻名的物种。这一成功主要归功于其对高温、酸性pH和渗透胁迫的高耐受性。该属的一些菌株已完全测序，其基因组已组装到染色体上。然而，全基因组序列仅以重叠群形式提供，并未完全注释。启动子、终止子和质粒已被广泛描述和表征。在奥戈塔酵母中，像甲醇氧化酶启动子、过氧化氢酶启动子和二羟基丙酮合酶启动子这样的启动子，在以甲醇为碳源时表现出最高的活性。终止子显示对基因表达有影响，影响mRNA稳定性，但与碳源无关。

直到最近，通过精确基因组修饰在奥戈塔酵母中进行遗传和代谢工程仍然费力，包括用长DNA片段侧接基因标记并通过同源重组进行基因组整合。非同源末端连接机制是奥戈塔酵母中首选的DNA修复途径，这导致随机基因组整合，是靶向遗传突变的一个瓶颈。为了克服后者，敲除了负责NHEJ活性的YKU80基因，提高了HR效率。最近，随着CRISPR-Cas9系统的建立，遗传工程的可能性得以扩展。

许多分子，主要是平台化学品和精细化学品，已利用甲醇作为唯一碳源和能源在奥戈塔酵母中生产。通过在多形奥戈塔酵母中表达还原性三羧酸循环，实现了L-苹果酸的生产。通过基因组整合三个密码子优化的基因，置于甲醇诱导型启动子控制下，苹果酸滴度达到14 g/L。通过代谢工程和适应性实验室进化实现了L-乳酸的生产。通过将来自瑞士乳杆菌的密码子优化的L-乳酸脱氢酶整合到基因组中，并在其基础上进行ALE，最终滴度达到3.8 g/L。丙酮的产量为8.6 mg/L。通过整合来自丙酮丁醇梭菌的三个酶的密码子优化序列，在甲醇作为碳源的情况下生产。异戊二烯生产是奥戈塔酵母中可实现的代谢工程可能性的另一个例子。通过整合来自白杨的异戊二烯合酶基因和来自酿酒酵母的截短版HMG-CoA还原酶基因，在饲喂甲醇的情况下，最高滴度报告为4.4 g/L。另一种主要平台化学品，即羟基丙酸的生产也在奥戈塔酵母中实现。通过引入来自嗜热弯曲菌的具有改进催化效率的突变版丙二酰辅酶A还原酶，并结合前体和辅因子增强以及补料策略，实现了7.10 g/L的滴度。广泛用于洗涤剂和化妆品工业的脂肪醇，通过多方面的研究，从甲醇生产，滴度达到3.6 g/L。首先，通过表达来自仓鸮的脂肪酰基辅酶A还原酶和来自酿酒酵母的醇脱氢酶，将脂肪醇合成途径隔离到过氧化物酶体中。此外，通过过表达内源性和异源基因以优化过氧化物酶体脂肪酰基辅酶A和NADPH的供应，增强细胞鲁棒性，并通过过表达DAS2增强甲醇耐受性。具有复杂15碳环状结构分子、高十六烷值和可持续性的β-法尼烯，是一种在奥戈塔酵母中通过广泛代谢工程从甲醇生产的特殊化学品。

科马嘎塔ella属

属于科马嘎塔ella属的甲基营养酵母，直到1995年被归类为毕赤酵母，如今更名为K. phaffii，是重组蛋白生产的成熟平台。K. phaffii的基因组已完全测序和注释，其在研究和工业上的成功归功于其能够在基本培养基上生长至高细胞密度，具有克雷布特里阴性表型，并显示出高产量。值得注意的是，用于K. phaffii的遗传工具已被广泛描述和开发。1985年，参与了甲醇氧化途径第一步酶促反应的醇氧化酶基因及其启动子被表征。随后，表达载体、整合载体和选择标记被描述。与其他甲基营养酵母类似，K. phaffii中的重组机制效率低于酿酒酵母。因此，最近为K. phaffii开发了功能性CRISPR-Cas9系统。

基于新旧技术，在利用甲醇作为唯一碳源和能源的K. phaffii中，扩展产品范围方面取得了显著进展。通过多方面的研究报道了苹果酸的生产。首先，表达了来自米根霉的甲醇诱导型rTCA途径。通过携带异源基因丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶的整合质粒实现基因组整合。为了克服苹果酸生产中常见的瓶颈，将来自粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白整合到基因组中并在pAOX1控制下过表达。此外，为了将代谢通量从XuMP循环重定向，删除了葡萄糖-6-磷酸异构酶。最后，在培养基中补充酵母提取物作为额外的氮源。这种多方面的方法从甲醇生产了2.79 g/L的苹果酸。另一种具有工业利益的有机酸，D-乳酸，从甲醇生产，最终滴度为3.48 g/L。K. phaffii本身不合成乳酸。因此，将来自肠膜明串珠菌的乳酸脱氢酶基因整合到基因组中，置于天然pAOX1和tAOX1终止子控制下。整合是使用靶向核糖体DNA基因座非转录间隔区的多拷贝整合载体实现的，从而产生高基因拷贝数。最近，通过工程化K. phaffii菌株，在生物反应器中生产了17 g/L的乳酸。该菌株通过整合密码子优化的来自植物乳杆菌的L-乳酸脱氢酶和利用CRISPR-Cas9系统删除L-乳酸细胞色素c氧化还原酶CYB2进行修饰。尽管这种整合足以生产乳酸，但只有通过过表达转录激活因子MXR1和MIT1，滴度才显著增加。为了生产衣康酸，通过整合来自土曲霉的衣康酸代谢途径的异源基因对科马嘎塔ella phaffii进行工程化。具体来说，将负责将顺乌头酸转化为衣康酸的cadA基因整合到酵母基因组中，置于pAOX1控制下。将转运蛋白基因mttA和mfsA整合到基因组中，分别置于中等强度和强组成型启动子控制下。进一步的过程优化，即在生物反应器中提高温度至32°C并采用多阶段过程，在约5天的甲醇补料后导致滴度达到55 g/L。另一个展示利用甲醇作为发酵底物可能性的有趣例子是β-丙氨酸，一种非必需氨基酸，也是唯一的天然β-氨基酸。该分子是许多氮基化合物的前体，但其工业合成需要苛刻、不环保的条件。在K. phaffii中，通过将来自枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱