综述：抗氧化活性与能力测定方法：从体外到体内模型的进展

《Food Production, Processing and Nutrition》：How to assess antioxidant activity? Advances, limitations, and applications of in vitro, in vivo, and ex vivo approaches

本综述系统评述了抗氧化活性测定方法，涵盖体外化学模型（如DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC）、细胞模型（CAA测定）及体内动物模型（啮齿类、犬类、灵长类等），重点探讨了抗氧化剂在清除自由基（ROS/RNS）、抑制脂质过氧化（如TBARS测定）和增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）等方面的机制与应用，为食品科学、药理学和临床医学中的抗氧化研究提供了方法论指导。

　　

抗氧化活性测定方法概述

抗氧化活性测定是评估化合物、提取物或生物样品中和自由基、缓解氧化应激能力的关键手段。氧化应激与多种疾病（如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病）的发生发展密切相关，因此准确评估抗氧化能力对于开发功能性食品、药物和化妆品至关重要。测定方法从简单的体外化学模型到复杂的体内生理系统，各有其优势和局限性。

体外化学测定方法

体外化学测定基于抗氧化剂与稳定自由基或氧化探针之间的反应，通过分光光度法、荧光法或化学发光法量化抗氧化能力。这些方法操作简便、成本低，适用于高通量筛选，但无法模拟生物体内的复杂生理环境。

自由基清除测定

DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）测定：DPPH自由基在517 nm处有特征吸收，抗氧化剂使其褪色，吸光度降低与抗氧化活性成正比。该方法快速、重现性好，但易受色素干扰，且对某些抗氧化剂（如硫醇类）反应缓慢。

ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）测定：ABTS自由基阳离子在734 nm处有最大吸收，抗氧化剂使其还原褪色。ABTS测定适用于水溶性和脂溶性抗氧化剂，且反应速度快（通常<30分钟），但可能高估某些酚类化合物的活性。

ORAC（氧自由基吸收能力）测定：通过荧光探针（如荧光素）的衰减曲线量化抗氧化剂抑制过氧自由基（由AAPH产生）的能力，以Trolox当量表示。ORAC能模拟链式反应，更贴近生物系统，但操作复杂且耗时。

还原能力测定

FRAP（铁离子还原抗氧化能力）测定：在酸性条件下，抗氧化剂将Fe³⁺-TPTZ还原为Fe²⁺-TPTZ，在593 nm处产生蓝色。FRAP简单快速，但仅检测还原性抗氧化剂，且不能在生理pH下进行。

CUPRAC（铜离子还原抗氧化能力）测定：利用Cu²⁺-新铜试剂被还原为Cu⁺-新铜试剂，在450 nm处检测。CUPRAC在生理pH（7.0）下有效，且对脂溶性和水溶性抗氧化剂均有响应，线性范围宽。

脂质过氧化抑制测定

β-胡萝卜素漂白测定：在亚油酸氧化系统中，β-胡萝卜素的褪色速率反映抗氧化剂抑制脂质过氧化的能力。该方法适用于脂溶性抗氧化剂，但可能受其他色素干扰。

硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定：通过检测丙二醛（MDA）与TBA的加合物在532 nm处的吸光度，评估脂质过氧化程度。TBARS广泛用于生物样品，但缺乏特异性（其他醛类也可反应）。

细胞抗氧化活性（CAA）测定

CAA测定弥补了化学模型的不足，通过人肝癌细胞（HepG2）、人结肠癌细胞（Caco-2）等模型，评估抗氧化剂在细胞内的吸收、代谢和活性。常用探针如二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），被ROS氧化后产生荧光，抗氧化剂抑制荧光生成。CAA提供更生理相关的数据，但受细胞类型、培养条件和探针特性的影响。

体内和离体模型

体内模型直接反映抗氧化剂在生物系统中的吸收、分布、代谢和排泄（ADME），以及整体抗氧化效果。

动物模型

啮齿类（大鼠、小鼠）：常用于研究抗氧化剂对氧化应激相关疾病（如糖尿病、肝损伤、衰老）的保护作用。例如，d-半乳糖诱导的衰老模型中，黄酮类化合物可提升SOD、CAT活性，降低MDA水平。

犬猫模型：犬类用于研究膳食抗氧化剂（如维生素E、类胡萝卜素）对氧化损伤（如红细胞膜、皮肤老化）的抑制；猫模型聚焦于内分泌疾病（如甲状腺功能亢进）中的氧化应激调控。

灵长类（猴子）：与人类生理最接近，用于验证抗氧化剂在神经退行性疾病（如帕金森病）、心血管疾病中的功效及机制。

离体测定

离体测定使用动物或人的组织、血液样品，评估抗氧化酶活性（如SOD、GPx）、氧化损伤标志物（如8-异前列腺素、蛋白质羰基）。例如，人低密度脂蛋白（LDL）氧化抑制测定，通过Cu²⁺诱导LDL氧化，检测抗氧化剂对共轭二烯形成的抑制。

抗氧化酶活性测定

超氧化物歧化酶（SOD）：通过抑制超氧阴离子（如由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产生）还原细胞色素c或氮蓝四唑（NBT），定量SOD活性。需使用氰化物区分Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。

过氧化氢酶（CAT）：直接测量H₂O₂在240 nm处的分解速率，或以钼酸盐等试剂检测剩余H₂O₂。

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）：以NADPH消耗或GSH减少量间接测定GPx催化H₂O₂或有机过氧化物还原的能力。

方法学挑战与发展趋势

当前抗氧化测定面临的主要挑战包括：①缺乏标准化方案，导致结果可比性差；②化学模型与生理相关性不足；③复杂样品中抗氧化剂的协同/拮抗效应难以量化。

未来发展方向包括：①开发更生理相关的3D细胞模型和类器官；②利用组学技术（如转录组、蛋白组）全面评估抗氧化响应；③结合纳米技术和传感器实现实时、高通量检测；④建立多方法联用策略（如HPLC-DPPH、LC-MS用于抗氧化成分分离与鉴定）。

结论

抗氧化活性测定方法从简单化学反应用到复杂生物系统，各有其适用场景和局限性。选择方法时需考虑抗氧化剂性质、目标应用及模型可靠性。多方法结合、标准化操作及生理相关模型的开发将推动抗氧化研究在疾病预防、食品开发和药物研发中的精准应用。