肠道上皮细胞亚细胞RNA图谱的系统发现：APEX-seq与MERFISH技术揭示空间转录组调控新机制

《Genome Biology》：Systematic discovery of subcellular RNA patterns in the gut epithelium

本研究针对肠道上皮细胞亚细胞RNA定位机制不清的问题，通过APEX-seq和MERFISH技术系统绘制了肠道类器官和组织中RNA的空间分布图谱。研究发现大量转录本呈现极性分布特征，鉴定出翻译依赖/非依赖的定位机制，揭示了3'UTR和RNA结合蛋白（如SNRNP70）的关键调控作用，为理解肠道生理功能提供了重要资源。

　　

在复杂的肠道上皮组织中，RNA分子的精确定位如同城市的交通网络一般，决定着蛋白质合成的时空控制。这种亚细胞水平的RNA分布对维持肠道稳态、营养吸收和病原体防御至关重要。然而，由于技术限制，科学家们一直难以全面揭示肠道上皮细胞中RNA的真实分布情况。传统研究多集中于少数RNA物种，缺乏系统性的全景视角。更关键的是，二维细胞培养模型无法真实模拟肠道上皮特有的顶端-基底极性特征，使得我们对体内RNA定位机制的理解存在巨大空白。

早期的激光捕获显微切割测序（LCM-seq）技术虽然揭示了部分RNA的不对称分布现象，但其灵敏度有限，可能遗漏了大量关键信息。肠道上皮细胞面临着独特的微环境挑战：顶端侧直接接触含有营养物质和微生物群的肠腔，基底侧则负责向固有层释放营养物质。这种独特的空间结构要求细胞必须建立精确的分子分布系统，而RNA定位正是这一系统的核心环节。

为了突破这一技术瓶颈，来自苏黎世联邦理工学院的研究团队在《Genome Biology》上发表了最新研究成果。他们巧妙结合了前沿的APEX-seq邻近标记技术和MERFISH空间转录组学方法，首次在肠道类器官和小鼠肠道组织中实现了亚细胞分辨率RNA图谱的系统性绘制。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先利用APEX2酶介导的邻近标记技术（APEX-seq）在肠道类器官中进行特定区域的RNA捕获；其次通过单分子荧光原位杂交（smFISH）进行验证；最后使用多重误差稳健荧光原位杂交（MERFISH）技术在肠道组织和类器官中同时对500个基因进行空间定位分析。研究还涉及了RNA结合蛋白质谱分析、基因敲低实验以及营养干预等功能性验证。

APEX-seq揭示肠道类器官中亚细胞转录本定位模式

研究人员将APEX2酶分别与顶端膜蛋白DPP4和细胞质蛋白GFP融合，通过生物素-酚标记系统特异性捕获不同区域的RNA。结果显示，在检测到的15,330个转录本中，有1,211个呈现顶端富集，1,128个呈现基底富集。基因功能分析表明，顶端富集的转录本主要参与营养感知消化、顶端膜受体等功能，而基底富集的转录本则与翻译、核糖体生物发生等过程相关。这一发现证实了RNA定位与蛋白质功能区域的高度一致性。

单分子RNA FISH发现颗粒状RNA模式

通过smFISH验证，研究人员不仅确认了APEX-seq结果的可靠性，还发现了一个有趣现象：许多顶端富集的转录本（如Pck1、Lct）呈现明显的颗粒状分布。这些RNA颗粒的直径普遍大于0.5μm，提示其可能由多个mRNA拷贝聚集而成。更重要的是，营养剥夺实验表明这些颗粒结构具有动态变化特性，在饥饿条件下Lct-mRNA的颗粒结构消失，而在重新喂食后又能恢复，说明环境因素对RNA定位模式的调控作用。

肠道类器官中翻译依赖和非依赖的RNA定位

为了探究RNA定位的分子机制，研究人员使用嘌呤霉素等翻译抑制剂进行处理。结果发现不同转录本对翻译抑制的反应存在显著差异：Enpep和Pck1等mRNA的定位发生明显改变（从顶端转向基底），而Lct、Apob和Net1等mRNA则保持原有定位。这表明肠道上皮细胞中存在多种RNA定位机制，既有依赖翻译过程和新生肽链的途径，也有不依赖翻译的机制。

识别3'UTR介导顶端mRNA定位的RNA结合蛋白

针对翻译非依赖的定位机制，研究人员重点研究了3'UTR的作用。将GFP编码序列与Lct、Apob或Net1的3'UTR融合后，这些嵌合mRNA成功复制了原始mRNA的定位模式。通过RNA结合蛋白质谱分析，发现剪接体成分SNRNP70与Lct-3'UTR特异性结合。进一步的功能实验表明，SNRNP70敲低不仅导致Lct-mRNA表达量下降，还破坏了其顶端颗粒结构的形成，证实了该RNA结合蛋白在调控RNA定位中的关键作用。

空间转录组学扩展肠道类器官转录本定位图谱

MERFISH技术对500个基因的分析进一步扩展了RNA定位图谱。研究发现，动力蛋白重链基因Dync1h1-mRNA在顶端区域高度富集，而驱动蛋白Kif5b-mRNA则在基底区域富集。这种分布模式与微管极性方向一致，提示运动蛋白可能参与自身mRNA的运输过程。整合分析显示，55%具有顶端GO术语的转录本确实在顶端区域富集，67%具有基底GO术语的转录本在基底区域富集，进一步支持了RNA定位与蛋白质功能区域的相关性。

小肠组织中沿隐窝-绒毛轴的mRNA定位模式变化

在真实肠道组织中，研究人员观察到了更为复杂的动态变化。他们将组织分为隐窝、绒毛底部、中部和顶部四个区域进行分析。结果显示，部分转录本（如Apob、Pigr）在所有区域保持稳定的定位偏好，而Vdr、Mtor等120个转录本则表现出明显的区域依赖性定位转换。特别值得注意的是，72个与营养相关的转录本在绒毛不同位置呈现动态定位变化，提示RNA定位可能参与调节肠道细胞沿成熟轴的功能适应性。

大肠组织的分区空间图谱

大肠组织分析揭示了与小肠不同的RNA分布特征。在隐窝顶部，34.14%的转录本呈现顶端定位，而在隐窝底部这一比例降至11.92%。近半数发生定位转换的转录本属于营养感知和消化相关类别，反映了大肠与小肠在生理功能上的差异。组织间比较发现，小肠绒毛顶部与中部区域有超过200个基底定位转录本重叠，而大肠基底区域与小肠隐窝顶端区域也有约200个转录本共享，提示不同肠道区段间存在保守的RNA定位调控网络。

这项研究通过多技术平台整合，首次在亚细胞水平系统描绘了肠道上皮的RNA空间分布图谱。研究不仅证实了RNA定位与蛋白质功能区域的相关性，还揭示了环境因素、翻译状态和RNA结合蛋白对定位模式的动态调控。特别重要的是，研究发现单个转录本在肠道不同区域可能采取完全不同的定位策略，这种可塑性为理解肠道生理功能提供了新的视角。

该研究建立的APEX-seq和MERFISH技术平台为后续研究提供了重要工具，而发现的SNRNP70等调控因子为理解RNA定位机制提供了新的分子基础。这些发现不仅深化了对肠道生物学的基本认识，也为相关疾病的研究提供了新的思路。未来，基于这一RNA定位图谱的进一步功能研究，有望揭示RNA空间分布在肠道疾病发生发展中的作用，为新型治疗策略的开发奠定基础。