交叉表达分析揭示小鼠脑切片中空间相邻细胞的基因表达协同调控

《Genome Biology》：Cross-expression meta-analysis of mouse brain slices reveals coordinated gene expression across spatially adjacent cells

本研究针对空间转录组学中基因间协同表达模式难以系统解析的问题，开发了“交叉表达（cross-expression）”分析方法，通过整合多组小鼠脑切片数据（约2500万细胞、8种技术平台），构建了跨表达元分析网络。研究发现，Drd1与Gpr6等帕金森病相关基因在纹状体中呈现显著的空间共表达模式，同时验证了配体-受体对（如Sst-Sstr2）的协同表达，为理解细胞间通讯及疾病机制提供了新视角。该方法无需依赖细胞类型标注或已知数据库，为空间转录组学提供了基因中心的研究框架。

　　

随着空间转录组学技术的飞速发展，科学家们能够同时获取细胞在组织中的位置信息及其基因表达谱，为理解细胞间相互作用提供了前所未有的机会。然而，当前研究多集中于细胞类型水平的通信分析，例如通过已知的配体-受体数据库推断细胞间相互作用。这种方法存在明显局限：首先，它严重依赖已有知识库，难以发现新的相互作用基因；其次，细胞类型注释的准确性受限于基因面板的大小，且分析通常在细胞类型层面进行整合，未能充分利用单细胞水平的数据；此外，细胞中心的研究框架使得跨数据集整合变得困难。

为了解决这些问题，Sarwar等人在《Genome Biology》上发表了题为“Cross-expression meta-analysis of mouse brain slices reveals coordinated gene expression across spatially adjacent cells”的研究。他们提出了“交叉表达（cross-expression）”这一全新概念，旨在从基因中心的角度，探索相邻细胞间基因表达的协调模式。交叉表达的核心是量化两个基因在空间相邻细胞中的互斥表达程度，即一个细胞表达基因A时，其相邻细胞表达基因B的可能性，同时严格控制细胞自身内部共表达带来的虚假关联。

研究团队开发了相应的R软件包，通过高效的矩阵运算和统计检验（如超几何检验），对基因表达和细胞位置矩阵进行分析，输出基因对的交叉表达显著性p值矩阵，进而构建交叉表达网络。

为了验证方法的有效性，研究人员整合了13项小鼠脑空间转录组学研究的数据，涵盖约2500万个细胞、695个脑切片（来自52个大脑）、8种技术平台（包括BARseq、MERFISH、Xenium等）。通过元分析构建的交叉表达网络显示出高度的模块化结构，其群落富集于突触信号、神经递质调控、细胞粘附、G蛋白偶联受体信号等空间生物学过程。

交叉表达概述

交叉表达定义为两个基因在相邻细胞间表达协调的程度。该方法通过超几何检验计算p值，量化基因A在细胞中表达而基因B在其最近邻细胞中表达的概率，并控制细胞自身共表达带来的偏差。效应大小通过比较交叉表达与共表达的比例（牛眼图）来评估，同时计算基因A表达细胞与其邻居表达基因B的皮尔逊相关性。该方法还可通过平滑基因表达（对细胞及其邻居的表达取平均）来研究更大空间尺度（如生态位）的关联。

交叉表达识别配体-受体对并揭示组织范围内的协调表达

在BARseq数据中，研究发现神经肽Sst与其受体Sstr2在皮层体感鼻区和内脏区域存在显著的交叉表达。牛眼图分析显示，与远邻相比，最近邻中交叉表达与共表达的比例更高（比值分别为1.8和1.6），表明协同表达具有空间特异性。全脑分析发现，20%的配体-受体对和4%的非信号基因对存在交叉表达，并发现了如Drd1-Penk、Sstr2-Vipr1等新的协同表达对，以及与细胞外基质和细胞骨架相关的基因对（如Col19a1-C1ql3、Marcksl1-Actb）。

交叉表达由细胞亚型组成的细微差异驱动

利用BARseq皮层细胞类型图谱数据，研究发现交叉表达既发生在相同细胞类型内（如L4/5 IT类型内Gfra1与Foxp2的交叉表达），也发生在不同细胞类型间（如Car3/CT与L4/5 IT间）。交叉表达细胞对中，64%的谷氨酸能细胞对属于不同亚型，而GABA能细胞对中不同亚型的比例仅为44%，反映了基因面板对兴奋性神经元亚型差异检测的优化。交叉表达模式重现了细胞类型组成的空间模式。

交叉表达为多研究分析提供通用框架，元分析网络揭示独特的空间生物学过程

跨数据集验证表明，交叉表达模式在数据集内部和之间具有一定可重复性，但在解剖学匹配的切片中重复性更佳。元分析网络（要求基因对在至少两个数据集中交叉表达）的模块化群落富集于突触组织、神经递质调控、细胞粘附、G蛋白偶联受体信号、中枢神经系统发育、淀粉样前体蛋白等空间过程。

帕金森病相关基因Drd1和Gpr6在纹状体中显示出高度可重复且局部的交叉表达模式

通过将切片注册到Allen CCFv3脑图谱，研究发现Drd1和Gpr6的交叉表达信号高度集中于纹状体区域。Drd1（多巴胺受体D1）激活促进运动 initiation，而Gpr6（G蛋白偶联受体6）的组成型活性抑制运动 initiation。在帕金森病中，多巴胺能神经元对Drd1的激活不足，同时Gpr6活性升高，导致运动启动困难。它们的空间协同表达提示针对这两个靶点的联合治疗可能具有协同效应。

交叉表达网络揭示Gpr20为核心基因并发现星形胶质细胞与脑微血管间可能的相互作用伙伴

在MERFISH数据构建的交叉表达网络中，Gpr20是一个核心节点（度数为40）。表达Gpr20的细胞在空间上呈线性分布，类似于血管结构。这些细胞的邻居富集内皮细胞标志物，但Gpr20本身与内皮标志物Igfr1共表达程度极低，表明其可能表达于血管周围的细胞中。通过进一步排除具有显著共表达的基因对，获得了一个子网络，其基因富集于内皮细胞增殖、血管内皮生长因子产生调控等功能，提示星形胶质细胞基因（如Egfr、Ppp1r3g）与血管相关基因（如Flt4、Tek、Tie1、Epha2）的交叉表达可能反映了血脑屏障及能量代谢中的相互作用。

交叉表达发现标记基因组合可界定丘脑并细化皮层第六层边界

研究发现，基因Lgr6与Adra2b虽然在全脑广泛表达，但它们的交叉表达显著富集于丘脑区域（91%的交叉表达细胞对位于丘脑）。Lgr6也与Ret在丘脑中交叉表达，而Adra2b与Ret在丘脑内共表达，表明它们可作为丘脑的组合标记基因。此外，皮层第六层标志物Foxp2与广泛表达的Cdh13的交叉表达，能够更精细地界定第六层边界，甚至识别出Foxp2单独标记所遗漏的L6 IT神经元。

交叉表达信号可跨数据集重复，全局共表达表明细胞分割可靠

MERFISH数据的生物学重复间交叉表达特征高度相似（平均相关性0.83）。BARseq矢状面和冠状面数据内部切片间的网络相似性高于不同大脑间的比较。在背腹方向上的交叉表达细胞密度分布在两个大脑间无显著差异的基因对占99%。通过比较空间转录组数据与无需细胞分割的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的基因共表达模式，发现两者高度相关（皮尔逊R=0.83），且与scRNA-seq和单核RNA测序（snRNA-seq）数据间的相关性（R=0.86）相当，表明细胞分割质量可靠。研究还验证了交叉表达对基因表达噪声阈值（1-10个分子）和细胞-邻居映射模式（一对一与多对一）的稳健性。

结论与意义

该研究提出的交叉表达框架为分析空间转录组数据提供了强大的新工具。它能够识别已知的配体-受体相互作用，发现新的空间协同表达基因对，其基因中心的视角支持跨数据集的整合元分析，揭示了与空间生物学过程相关的保守网络模块。研究证实了帕金森病相关基因Drd1与Gpr6在纹状体中的空间协同表达，提示了潜在的治疗新思路。同时，通过发现组合解剖学标记和揭示星形胶质细胞与微血管的潜在相互作用，展示了该方法在解析组织结构和功能方面的广泛应用前景。随着空间转录组技术基因面板的扩大和数据质量的提升，交叉表达分析将能更深入地揭示组织内基因表达的空间协调规则。