人类视网膜祖细胞动态特性研究：VSX2阳性细胞分子图谱与TNFRSF1B新标记物的发现

《Stem Cell Research & Therapy》：Dynamic molecular and cellular characteristics of VSX2-positive retinal progenitor cells in human retinal organoids

本研究针对视网膜退行性疾病治疗中人类视网膜祖细胞（RPC）特性不清、缺乏表面标记物的难题，通过VSX2-eGFP报告基因hiPSC源视网膜类器官模型，系统解析了RPCs在不同发育阶段的动态分子特征，首次揭示TNFRSF1B作为RPCs分选新靶点，为细胞治疗提供关键理论依据。

　　

在全球数千万视网膜退行性疾病患者期盼光明重现的今天，细胞替代疗法被视为最有希望的治疗策略之一。人类视网膜祖细胞（RPC）因其具有自我更新和分化为所有主要视网膜细胞类型的双重能力，成为理想的移植供体细胞。然而，这类细胞的临床应用却长期面临两大瓶颈：一方面，从人类胎儿视网膜分离RPCs存在来源有限和伦理争议；另一方面，RPCs的分子和细胞特性特别是表面标记物表达谱系尚未明确，导致无法高效纯化目标细胞。尽管人类多能干细胞（hPSC）技术和三维视网膜类器官（RO）培养体系的突破为RPCs获取提供了无限来源，但如何精确识别、分离特定发育阶段的RPCs群体，仍是阻碍其临床转化的关键科学问题。

针对这一挑战，Zheng等人在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了最新研究成果。研究团队独辟蹊径，利用前期构建的VSX2增强绿色荧光蛋白（VSX2-eGFP）报告基因人诱导多能干细胞（hiPSC）系，结合视网膜类器官培养系统、荧光激活细胞分选（FACS）、批量RNA测序（RNA-seq）等多学科技术，首次系统描绘了人类VSX2阳性RPCs在不同发育阶段的动态分子图谱，并筛选出具有临床应用潜力的新型表面标记物。

研究采用的关键技术方法包括：利用VSX2-eGFP报告基因hiPSC系进行视网膜类器官定向分化，通过免疫染色验证报告基因可靠性；在不同发育时间点（D28、D55、D118、D170）对VSX2-eGFP阳性细胞进行FACS分选；对分选细胞进行批量RNA-seq转录组分析；通过免疫染色和流式细胞术验证候选生物标志物表达。所有hiPSC系均来源于匿名捐赠细胞并经伦理审查批准。

VSX2-eGFP报告基因准确模拟内源性VSX2表达动态

研究证实VSX2-eGFP hiPSC在维持多能性和视网膜类器官分化能力方面与亲本细胞无显著差异。RNA-seq分析显示D60类器官转录组高度相关（Pearson相关系数0.997）。从D12-14开始，VSX2-eGFP信号在眼场样结构中首次出现，随后特异性地分布于视杯样结构的中央神经视网膜（NR）区域，而非视网膜色素上皮（RPE）区域。免疫染色结果显示，从D16到D195，报告基因信号与内源性VSX2蛋白表达高度一致，虽在D55类器官最内层有短暂信号残留，但随成熟过程逐渐减弱，充分验证了该报告系统用于VSX2阳性细胞追踪和分选的可靠性。

VSX2-eGFP阳性细胞呈现阶段特异性细胞特征

在发育极早期（D14-D30），VSX2-eGFP阳性细胞高表达VSX2、RAX、SFRP2等早期RPC相关基因，而脑发育基因（FOXG1、SOX1）和RPE标记基因（OTX2、BEST1）低表达。免疫染色显示绝大多数VSX2-eGFP阳性细胞共表达RPC标记RAX，而不表达SOX1或OTX2，表明该阶段细胞主要为RPCs。

在早期阶段（D31-D90），VSX2-eGFP阳性细胞高表达VSX2、SOX9、LHX2等RPC相关基因及MKI67、PCNA等增殖基因，而视网膜 ganglion 细胞（ATOH7、POU4F2）和光感受器细胞（CRX、RXRG）标记基因低表达。免疫染色证实绝大多数细胞共表达MCM2、Ki67等增殖标记及RAX、SOX9、PAX6等RPC标记，表明其为增殖性RPCs。

在晚期阶段（D150后），VSX2-eGFP阳性细胞高表达双极细胞标记（PCP2、VSX1）和 Müller 胶质细胞标记（GLUL、RLBP1），而RPC增殖标记（Ki67、RAX、SOX9、PAX6）及光感受器标记（RCVRN、rhodopsin）均不表达，表明其主要分化为双极细胞。

VSX2-eGFP阳性细胞存在显著发育阶段转录异质性

基因集富集分析（GSEA）显示，D55细胞富集于细胞周期和DNA复制通路，D28细胞富集于核糖体和粘附连接通路，D118细胞富集于光转导和谷氨酸能突触通路，而D170细胞则富集于Notch信号通路。不同阶段特异性表达基因谱系进一步证实了RPCs的时空异质性，如D28特征基因LIN28A、D55特征基因ONECUT1、D118特征基因PRDM13以及D170特征基因SLC4A10等。

分化簇（CD）生物标志物动态表达谱揭示TNFRSF1B新靶点

研究系统分析了394种CD生物标志物的动态表达模式，发现127个差异表达CD基因（DECDGs）。其中D28阶段富集与增殖、迁移相关的CD24、TNFRSF1B等；D55阶段富集与组织形态发生相关的IFITM1、FZD10等；D118阶段富集与神经发育相关的NCAM1等。特别值得注意的是，肿瘤坏死因子受体超家族成员1B（TNFRSF1B）在早期RPCs（D28、D55）中高表达（FPKM>5），而在晚期阶段（D118、D170）显著下降（FPKM<1），且VSX2-eGFP阴性群体中几乎不表达。

免疫染色和流式细胞术验证显示，TNFRSF1B蛋白与VSX2-eGFP阳性细胞共定位，且在D35-D55神经视网膜中表达最高，随后逐渐下调。流式分析证实早期类器官中92±5%的VSX2阳性细胞和86±7%的Ki67阳性细胞同时表达TNFRSF1B，支持其作为RPCs分选候选标志物的潜力。

该研究通过多维度技术平台，首次系统解析了人类视网膜祖细胞在不同发育阶段的动态分子特征，揭示了VSX2阳性群体的时空异质性。研究发现不仅验证了VSX2作为RPCs标志物的可靠性，还首次报道TNFRSF1B作为潜在的新型表面标记物，为解决RPCs临床应用中的细胞分选难题提供了关键理论依据和技术支持。尽管研究存在报告基因与内源性蛋白表达短暂不匹配等局限性，但其建立的CD生物标志物表达谱系将为视网膜发育研究、疾病诊断和治疗提供宝贵资源。未来研究可结合单细胞测序技术进一步解析RPCs异质性，并探索TNFRSF1B在视网膜发育中的功能机制，为视网膜退行性疾病的细胞治疗开辟新途径。