肺间充质基质细胞异质性起源与功能特征及其对肺疾病治疗的意义

《Stem Cell Research & Therapy》：Heterogeneous origins and functions of lung mesenchymal stromal cells

本研究针对肺间充质基质细胞（MSCs）起源不明和功能异质性等关键科学问题，通过谱系追踪和转录组分析技术，首次在小鼠和人类肺组织中鉴定出两个功能迥异的MSC亚群：胚胎肺源性的mG+亚群和未知起源的mT+亚群。研究发现这两个亚群在增殖、黏附、免疫调节及支持肺泡上皮生长等方面表现出显著差异，为理解肺损伤修复机制和开发精准MSC疗法提供了重要理论依据。

　　

在干细胞研究领域，肺间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）因其在肺疾病治疗中的潜力而备受关注。然而，尽管大量研究探索了MSCs及其分泌组治疗各种肺疾病的效果，但始终未能展现出稳定的治疗效果。这背后的根本原因在于，我们对肺内源性MSCs的基本生物学特性了解甚少，特别是它们的发育起源、异质性以及在肺内稳态和损伤修复中的具体功能。

以往的研究表明，组织驻留的MSCs在器官发生、组织修复和炎症反应中扮演着关键角色。肺组织中也存在MSCs，但其精确的来源和细胞亚群构成一直是个谜。这种认知上的局限严重制约了有效MSC疗法的开发。为了突破这一瓶颈，研究人员将目光投向了肺发育过程。在胚胎发育早期，肺上皮起源于前肠内胚层，并嵌入周围的脏壁中胚层形成肺原基。上皮与间充质之间的相互作用对肺器官发生至关重要。如同肺上皮细胞一样，肺间充质祖细胞在器官形成之初就已确定，并发育成多种间质细胞系。发育完成后，肺MSCs被认为在维持组织稳态中起关键作用，并且其功能改变与多种肺疾病相关。

为了深入探究肺MSC的生物学特性，本研究团队利用了一种经过前期表征的胎儿肺间充质特异性报告基因小鼠模型——Tbx4-rtTA/TetO-Cre/mT-mG模型。在这个系统中，Tbx4肺增强子能够特异性驱动胎儿肺间充质祖细胞表达rtTA。在多西环素诱导下，rtTA激活Cre表达，从而切除floxed-mTomato（mT）DNA盒，并将报告基因表达从默认的mT转换为下游的mGFP（mG），永久性地用GFP标记这些祖细胞及其后代。这一策略使得研究人员能够区分来源于胎儿肺间充质祖细胞的MSCs（mG⁺）和来源于其他组织的MSCs（mT⁺）。

研究人员从出生后1天到6个月的小鼠肺组织中分离细胞，并在MSCs培养体系中进行低密度接种。结果发现，形成的细胞集落确实表达不同的报告基因：mG⁺或mT⁺。随着小鼠年龄增长，流式细胞术分析显示，mG⁺细胞的比例逐渐下降，这表明在出生后，可能有其他来源的MSCs（mT⁺）进入肺组织。研究人员通过细胞表面标志物检测和多向分化潜能实验，证实了这两个亚群的细胞都符合国际细胞治疗学会（International Society for Cell Therapy）定义的MSCs标准特征，即表达Sca1、CD90、CD105等标志物，不表达造血细胞（CD45, CD34）、内皮细胞（CD31）或上皮细胞（CD326）标志物，并且能够在体外诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞。

为了在分子水平上深入理解这两个MSC亚群的差异，研究人员对从3月龄小鼠肺中分选出的mG⁺和mT⁺ MSCs进行了批量RNA测序（Bulk RNA-seq）。主成分分析和层次聚类分析均清晰地显示，这两个亚群拥有截然不同的转录组谱。热图和 smear 图直观地展示了大量的差异表达基因（DEGs），例如Cxcl12在mG⁺细胞中高表达，而Meox2在mT⁺细胞中高表达。这些发现通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）得到了验证，排除了由于Cre介导的遗传标记效率不均一所造成假象的可能性，证实了这两个亚群是真正生物学意义上不同的细胞群体。

一个关键的问题是，在小鼠中发现的这种MSC异质性是否在人类中也存在？为了回答这个问题，研究人员从本地器官获取组织库（LifeCenter Cincinnati）获得了去标识化的正常供体人肺组织，采用与小鼠实验相同的流程分离和培养人肺MSCs。他们对随机挑选的多个独立细胞集落进行了批量RNA测序。层次聚类分析成功地将这些人肺MSCs分成了两组，其基因表达模式分别与小鼠的mG⁺和mT⁺ MSCs相似，因此被命名为人mG⁺样亚群和人mT⁺样亚群。同样，这两组人源细胞也通过了MSCs表面标志物鉴定和多向分化能力验证。这表明，肺MSCs的功能异质性在小鼠和人类之间是保守的，大大提升了研究发现的普遍意义。

那么，这两个MSC亚群在功能上究竟有何不同？研究人员整合分析了小鼠和人类MSCs的RNA-seq数据，发现了600多个在两个物种间变化趋势一致的保守差异表达基因。基因本体（GO）富集分析揭示了它们的功能倾向：mG⁺/mG⁺样亚群的基因富集在细胞分裂、细胞周期和DNA修复等过程；而mT⁺/mT⁺样亚群的基因则富集在细胞黏附、迁移、细胞外基质组织和血管生成等方面。随后的功能实验完美地验证了这些预测：mG⁺/mG⁺样MSCs的增殖速度显著快于mT⁺/mT⁺样亚群；相反，mT⁺/mT⁺样MSCs在胶原蛋白I或纤维蛋白原包被的培养板上展现出更强的黏附能力。在基质胶（Matrigel）管形成实验中，mG⁺ MSCs形成的管网分支更多、环路更短，而mT⁺ MSCs形成的分支较少但环路更长，提示它们在支持血管生成方面的作用模式可能不同。

MSCs的一个重要特性是免疫调节能力。研究人员将人肺MSCs亚群与Jurkat T细胞共培养，发现两个亚群都能抑制T细胞增殖，但mT⁺样亚群的抑制能力明显更强（抑制倍数4.2倍 vs 1.9倍）。这表明mT⁺样MSCs可能在肺的免疫微环境调控中扮演更重要的角色。

作为潜在的“生态位”（niche）细胞，MSCs支持上皮干细胞/祖细胞生长的能力至关重要。研究人员利用3D肺泡球（alveolosphere）形成实验来评估这一功能。他们将分离自Sftpc-GFP报告小鼠的原代肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC2）分别与小鼠mG⁺或mT⁺ MSCs在基质胶中共培养。两周后，与mG⁺ MSCs共培养的组产生了更多、更大的肺泡球。在平行的人源细胞实验中，使用诱导多能干细胞（iPSC）分化来源的AEC2（iAEC2）与两组人肺MSCs共培养。结果显示，虽然两个MSC亚群都能增加肺泡球的数量，但只有与mG⁺样MSCs共培养才能显著增大肺泡球的尺寸。这些结果强有力地表明，mG⁺/mG⁺样MSCs在支持肺泡上皮生长和再生方面具有更优越的功能。

本研究主要应用了以下几种关键技术方法：1）利用Tbx4-rtTA/TetO-Cre/mT-mG谱系追踪小鼠模型，结合多西环素诱导，在体标记并区分不同发育起源的肺MSCs亚群；2）通过流式细胞术分选和细胞集落分离技术，分别从小鼠和人类（来自器官捐献者）肺组织中分离和纯化MSCs亚群；3）采用批量RNA测序（RNA-seq）和生物信息学分析（差异表达基因分析、GO富集分析），在转录组水平上系统比较不同MSC亚群的分子特征；4）运用一系列体外功能实验，包括EdU掺入法检测细胞增殖、细胞黏附实验、基质胶管形成实验、MSC与Jurkat T细胞共培养评估免疫抑制功能，以及3D肺泡球共培养体系评估对肺泡上皮生长的支持作用，来验证不同亚群的功能差异。

研究结果

Identification of mouse lung MSC subpopulations by lineage tracing

通过谱系追踪方法，研究人员成功鉴定出小鼠肺内存在两个MSCs亚群：mG⁺亚群（源自胚胎肺间充质祖细胞）和mT⁺亚群（起源未知）。这两个亚群在细胞培养中均表现出典型的MSCs特性，包括特定表面标志物表达和多向分化潜能。随着小鼠年龄增长，mG⁺细胞比例下降，提示mT⁺亚群可能在出生后通过循环系统募集至肺。

Mouse lung MSC subsets exhibit unique transcriptomic profiles

批量RNA测序分析显示，mG⁺和mT⁺ MSCs拥有截然不同的基因表达谱，存在大量差异表达基因，如mG⁺细胞高表达Cxcl12，而mT⁺细胞高表达Meox2。这从转录组水平证实了两个亚群的生物学异质性。

Lung resident MSC subpopulations were conserved in human

从人肺组织中分离的MSCs，通过转录组分析同样被分为两个亚群，其基因表达模式分别与小鼠的mG⁺和mT⁺ MSCs相似，表明肺MSCs的异质性在物种间是保守的。

Functional divergences in cell behavior and interactions were observed between lung MSC subpopulations

功能实验证实了两个亚群的显著差异：mG⁺/mG⁺样亚群增殖更快；mT⁺/mT⁺样亚群黏附能力更强、免疫抑制（抑制T细胞增殖）作用更显著；在管形成实验中，两个亚群形成管网的形态学特征不同。

Lung MSC subpopulations exhibit different activity to support type 2 alveolar epithelial cell growth in 3-D culture

在3D肺泡球形成实验中，mG⁺/mG⁺样MSCs展现出更强的支持肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC2）生长和形成肺泡球的能力（球体数量更多、尺寸更大），提示其在肺泡再生生态位中可能发挥更重要的作用。

结论与意义

本研究首次明确揭示了肺驻留MSCs在发育起源和功能上存在异质性，鉴定出两个功能互补的亚群：一个倾向于支持上皮再生（mG⁺/mG⁺样），另一个倾向于参与免疫调节和组织重塑（mT⁺/mT⁺样）。这一发现突破了以往将肺MSCs视为均质群体的局限，为理解肺在稳态维持和损伤修复中的细胞机制提供了新的框架。

其重要意义在于：1）深化了对肺间质细胞复杂性的基础生物学认识；2）为解释肺再生能力随年龄增长而下降的现象提供了潜在细胞基础（mG⁺生态位细胞比例减少）；3）为理解多种肺疾病（如肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病）的发病机制提供了新视角，不同MSC亚群的功能失衡可能参与疾病过程；4）对MSC疗法的开发具有重要指导意义，提示未来需要根据治疗目标（促进再生还是抑制炎症）选择或富集特定功能的MSC亚群，而非使用混合细胞群体，从而有望显著提高细胞治疗的有效性和精准性。这项发表在《Stem Cell Research & Therapy》上的研究，为最终实现有效的肺疾病干细胞治疗奠定了坚实的理论基础。