综述：汗腺类器官的进展：构建、分子机制与挑战

《Stem Cell Research & Therapy》：Advances in sweat gland organoids: construction, molecular mechanisms, and challenges

本综述系统总结了汗腺发育的分子调控机制与汗腺类器官（SGO）构建的最新进展。文章重点探讨了多种细胞来源（如汗腺干细胞、间充质干细胞（MSC）、重编程细胞）及三维（3D）培养微环境对SGO组装的影响，并展望了SGO在烧伤后汗腺再生中的应用潜力。尽管在细胞诱导效率和功能重建方面仍面临挑战，但SGO技术为恢复烧伤患者汗腺功能提供了一种新颖的治疗策略。

　　

汗腺（SGs）在维持机体整体稳态和皮肤稳态中扮演着关键角色。然而，由于汗腺的再生能力极其有限，烧伤和创伤常常导致不可逆的汗腺丧失。近年来，三维（3D）细胞培养技术和干细胞研究的进展，凸显了类器官技术在再生医学中的潜力。

汗腺的生理学

外泌汗腺（ESGs）约占所有汗腺的90%，在体温调节中起核心作用。其结构主要分为分泌部和导管。分泌部位于真皮内，由腺管卷曲形成的球状结构构成，包含明细胞、暗细胞和周围的肌上皮细胞。导管则由2-3层立方细胞构成，从真皮深层延伸至表皮并开口于皮肤表面。汗腺起源于胚胎外胚层，在胚胎发育第12-20周，K5⁺和K14⁺的多能表皮基底细胞形成汗腺芽，随后内陷形成双层导管，延伸至真皮形成基板，即汗腺的雏形结构。每个表皮汗腺芽都需要真皮中相应的微环境（niche）来启动其内陷和发育，这为人工构建微环境诱导汗腺再生提供了理论基础。

汗腺发育与再生的调控

皮肤附属器的发育包括诱导、进展和成熟三个阶段。精确的信号通路是调控汗腺发育的关键基础。迄今为止，研究已揭示了多个信号通路在汗腺发育中的作用，包括Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路、外异蛋白（Eda）/Edar/核因子κB（NF-κB）信号通路、音猬因子（Shh）信号通路、骨形态发生蛋白（BMP）信号通路和细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路。

除了上述经典通路，近期研究还发现了其他调控汗腺发育的信号因子，如Notch4、胶原三螺旋重复蛋白1（CTHRC1）、 engrailed1（EN1）、Brn2、过氧化物酶2（PRX-2）和叉头框蛋白a1（Foxa1）。Notch4参与管状结构的形态发生，研究发现其在3D培养条件下能通过上调干性标志物Oct4增强间充质干细胞（MSC）向汗腺细胞（SGC）的分化效率。CTHRC1是一种细胞外基质（ECM）蛋白，其缺失会损害汗腺功能，可能与汗腺周围毛细血管网络减少有关，它可能通过上调Hmox1基因表达正向调控BMP2，从而促进MSC向SGC分化。EN1在富含汗腺的小鼠掌垫表皮中高表达，其增强子活性对汗腺数量有重要影响。Brn2作为β-连环蛋白的下游信号，其过表达会导致小鼠汗腺体积显著减小和分泌功能受损。PRX-2可能通过BMP介导的信号通路影响汗腺发育。Foxa1特异性定位于汗腺分泌细胞，可能通过调控Na⁺-K⁺-ATP酶的表达来影响汗腺分泌部的发育和功能，其表达受Eda通路调控。

这些新发现的通路与Wnt、Eda、BMP等经典通路之间存在潜在的相互作用，共同构成了复杂的汗腺发育调控网络。类器官的发育调控机制在很大程度上模拟了生理器官的发育，因此，阐明汗腺发育的调控机制不仅能指导体内汗腺重建，也为优化体外SGO组装策略提供了宝贵见解。

汗腺再生的挑战

再生医学的关键在于修复、替代或再生细胞、组织和器官，最终实现某些组织或器官的功能恢复。干细胞因其自我更新和多向分化潜能成为再生过程中的关键细胞。研究表明，成熟汗腺组织中的某些细胞保留了干性。例如，人汗腺中含有巢蛋白（nestin）阳性的干细胞，小鼠皮肤中存在表皮祖细胞、导管祖细胞、腺体祖细胞和肌上皮祖细胞。然而，在严重创伤或烧伤后，受损汗腺内的干细胞无法再生汗腺，即使伤口瘢痕愈合后，新生的表皮干细胞也无法分化为汗腺细胞，导致愈合区域丧失排汗功能。

汗腺再生障碍的主要原因在于干细胞微环境的改变。烧伤后瘢痕愈合导致：（1）瘢痕区域细胞数量和类型显著改变，破坏了细胞间相互作用；（2）与汗腺发育相关的ECM代谢紊乱；（3）瘢痕组织中的基底膜失去正常结构和功能。此外，瘢痕组织的致密结构也是汗腺三维重建的一大障碍。尽管瘢痕组织中仍残存少量具有汗腺再生生物学基础的细胞（如K19⁺细胞），但肉芽组织的生长速度远快于汗腺再生，过度增殖的胶原组织阻碍了汗腺的生长。另一个关键问题是，当汗腺干细胞或祖细胞被分离体外培养时，大多数在3D培养条件下会迅速分化为角质形成细胞，丧失其特异性表型，这导致了汗腺再生最关键的前提——细胞来源的缺失。

类器官方法的优势

相较于诱导其他细胞分化为汗腺细胞或抑制瘢痕形成，类器官提供了一种更直接的途径。汗腺类器官（SGO）可在体外培养形成，细胞来源更广（可诱导自多种干细胞），且具备正常汗腺的组织结构和排汗生理基础，从而避免了肉芽组织的阻碍。一旦SGO与周围组织完成解剖和生理整合，即可实现伤口部位汗腺结构和功能的恢复。研究证实，SGO移植在促进小鼠模型汗腺重建方面显著优于单纯细胞移植，显示出其在汗腺再生中的显著优势。

汗腺类器官的细胞来源

合适且充足的细胞来源是培养SGO的基本前提。目前，研究人员已成功从多种干细胞来源或通过细胞重编程技术诱导出汗腺样细胞，进而实现了功能性SGO的体外培养。

汗腺来源的干细胞

研究人员将小鼠或人汗腺细胞（SGC）接种于基质胶（Matrigel）中，成功组装出具有汗腺样外观的类器官。添加TGF-β抑制剂、BMP和cAMP激活剂等源自天然汗腺发育通路的因子可有效提高类器官组装效率。这些类器官保留了显著的干性，移植到小鼠烧伤掌垫后能有效促进汗腺再生和伤口修复。从人汗腺细胞培养得到的球形类器官表达K5、K14、K7、K19等关键汗腺标志蛋白，其结构（基底膜和肌上皮细胞环绕管腔）与天然汗腺相似，并表达暗细胞标志物GCDFP-15和明细胞标志物CAII，极性也与天然汗腺相近。悬滴培养系统也能获得表达NKCC1和AQP5等汗腺标志蛋白的球形类器官，且在乙酰胆碱刺激下表现出显著的钙离子内流，证明了其排汗的生理基础。

尽管从汗腺细胞培养SGO具有操作简单、与天然汗腺组织结构和生理相似等优点，但其临床应用存在明显局限性：从大面积烧伤患者身上获取足量健康汗腺细胞不现实，且人汗腺细胞培养周期长（需数周），传代次数有限（仅2-3次），难以满足治疗所需细胞量。此外，使用同种异体细胞还需解决移植免疫问题。

其他组织来源的干细胞

间充质干细胞（MSC）可从骨髓、脂肪、脐带等组织获取，具有多向分化潜能。研究报道，通过与其他细胞共培养、基因编辑（如CRISPR/dCas9激活Eda转录）、或使用角质细胞生长因子、MicroRNA、Notch4、TNF-α等因子诱导，骨髓来源的MSC（BM-MSC）和脐带来源的MSC（UC-MSC）均可分化为汗腺样细胞，并在移植后重建功能性汗腺。人羊水干细胞在特定条件下诱导也能上调Eda/Edar表达，产生汗腺标志蛋白，形成汗腺样管状结构。人包皮来源的表皮干细胞转染has-miR-203双链模拟物后也可表达汗腺标志物，表明其可能分化为汗腺细胞。

通过重编程获得汗腺样细胞

研究尝试通过重编程其他细胞获得汗腺样细胞。例如，过表达NF-κB和Lef-1基因可将成纤维细胞重编程为表达汗腺特异性标志物的细胞；过表达Irf6或FoxC1可将小鼠表皮细胞重编程为汗腺样细胞，并促进体内汗腺再生。为提高重编程效率，研究人员采用了基因与化学方法结合的策略，如在强制表达Eda的基础上，联合使用TGF-β1抑制剂、WNT激动剂、异丙肾上腺素、BMP4和视黄酸受体α激动剂等化学诱导剂，可高效获得汗腺样细胞（55.79%的细胞表达K18），并成功构建出结构与表型类似天然汗腺的球形类器官，在体内重建功能性汗腺并促进伤口愈合。

尽管干细胞诱导和重编程都能成功获得汗腺样细胞，但仍需进一步缩短诱导时间、提高诱导效率，以获得足够数量的细胞用于大面积烧伤治疗。同时，研究表明直接移植诱导的汗腺样细胞重建汗腺的效率远低于SGO移植。

汗腺类器官的组装条件

为了进一步提高SGO培养效率，研究人员着重于优化细胞培养微环境，包括ECM的材料、物理参数和生化信号。

ECM的材料

基质胶（Matrigel）是3D培养中最常用的基质，能有效模拟体内ECM，促进SGO的培育。此外，明胶-海藻酸钠、明胶甲基丙烯酸酯等材料更适合3D打印，可精确设计用于细胞分化和组织形成。研究利用3D打印技术创建ECM仿生结构，成功诱导表皮干细胞分化为汗腺样细胞并形成SGO。这些材料具有良好的稳定性、生物相容性和机械耐久性。

ECM的物理参数

基质的孔径和刚度显著影响SGO的形成。研究发现，3D打印基质的不同孔径影响表皮干细胞向汗腺样细胞的分化效率及类器官形成效率，300μm的孔径利于SGO形成，且一旦失去3D结构支持，类器官发育即停止。基质的刚度通过Yes相关蛋白（YAP）介导的机械转导影响MSC向SGC的分化，较硬的水凝胶更能上调SGC表型、功能及相关通路的表达。CTHRC1和Hmox1在3D基质中高表达，其在MSC向汗腺样细胞分化中起重要作用。

ECM中的生化信号

微环境中的各种生化因子（细胞因子、激素、生长因子）对调节细胞活动和决定细胞命运至关重要。在汗腺再生研究中，添加特定细胞因子和化学因子对于细胞向SGC转化或SGO组装至关重要。例如，热休克处理的SGC与MSC共培养可诱导MSC分化，而3D共培养环境对此过程有促进作用。Eda、BMP4等因子在诱导过程中发挥关键作用。此外，微环境中的生化信号也影响细胞聚集。内皮细胞与真皮乳头细胞的相互作用可通过EDN1-EDNRA和CTF1-IL6ST通路影响皮肤类器官的组装效率。汗腺与血管的相互作用表明，微血管分泌的VEGF、IGF、FGF以及其解剖结构影响汗腺发育。利用3D打印构建类似天然汗腺周围血管微环境的体外模型，可成功诱导脂肪来源的MSC（AD-MSC）分化为汗腺样细胞并形成SGO。EGFR抑制剂AG1478会显著阻碍汗腺细胞在基质胶中聚集形成球形类器官。

总结与展望

汗腺类器官（SGO）研究在获取汗腺细胞（SGC）、促进SGC聚集和组装SGO等方面取得了显著进展，并在动物实验中成功实现了汗腺重建。然而，当前方法仍存在一些局限性：细胞诱导和SGO组装效率需进一步提高；烧伤创面紊乱的ECM问题尚未解决；从人工基质分离后，SGO的细胞活力会显著下降，移植到受伤区域的细胞留存率也较低。未来研究可能将SGO组装与皮肤替代物相结合，开发出包含汗腺、毛囊等功能性类器官的高级皮肤替代物。

临床上已有应用MSC诱导的汗腺样细胞成功重建人瘢痕组织汗腺的案例，但该方法的广泛应用受限于分化效率低、体外诱导时间长等问题，其长期疗效仍需进一步验证。因此，将该技术转化为大面积烧伤患者有效的汗腺再生手段，需要更广泛和深入的研究。此外，大多数相关研究主要关注获得SGO的方法，往往忽略了类器官组装过程的内在机制。相信推进对这些机制的研究将为SGO的组装及相关汗腺再生研究提供更好的指导。