miR-125b-5p通过靶向Bak1调控微小隐孢子虫感染诱导的HCT-8细胞线粒体凋亡通路

《Parasites & Vectors》：MiR-125b-5p targets Bak1 to regulate HCT-8 cell apoptosis in response to Cryptosporidium parvum infection via mitochondrial pathway

本研究针对微小隐孢子虫感染过程中宿主细胞凋亡调控机制不明确的问题，通过系统分析miR-125b-5p对Bak1的靶向调控作用，揭示其通过线粒体通路（Cytochrome c/Caspase-9/Caspase-3）调控细胞凋亡与寄生虫负荷的新机制，为宿主-寄生虫互作研究提供新的理论依据。

　　

微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种严重危害全球公共卫生的人畜共患寄生原虫，尤其对免疫缺陷人群和儿童具有高致病性。当前针对隐孢子虫病的治疗手段极为有限，唯一获批药物硝唑尼特仅对免疫功能正常者有效，且尚无可用疫苗。这种困境使得探索宿主与寄生虫相互作用的分子机制成为开发新防控策略的关键突破口。

在宿主与病原体的博弈中，细胞凋亡作为程序性死亡的重要形式，扮演着双重角色：一方面可清除被感染细胞限制病原体扩散，另一方面过度凋亡会破坏肠道屏障功能。既往研究表明，微小隐孢子虫能够通过调控宿主细胞凋亡促进自身生存，但其具体分子机制尚未完全阐明。近年来，微小RNA（miRNA）作为基因表达的关键调控因子，在宿主抗寄生虫免疫应答中的作用日益受到关注。这些长约20-23个核苷酸的非编码RNA通过降解或抑制靶信使RNA（mRNA）翻译，精准调控包括凋亡在内的多种细胞过程。

河南农业大学研究团队长期致力于宿主miRNA在隐孢子虫感染中的作用机制研究。在前期工作中，他们通过测序技术发现微小隐孢子虫感染早期HCT-8细胞中多个miRNA表达发生显著变化，其中miR-125b-5p的表达动态尤为引人注目。本研究聚焦于这一特定miRNA，深入探索其在调控宿主细胞凋亡及影响寄生虫负荷中的功能与机制。

研究人员运用多种关键技术方法开展研究：通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达变化与寄生虫负荷；利用流式细胞术分析细胞凋亡率；采用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的直接相互作用；通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达水平；使用JC-1探针评估线粒体膜电位变化。实验所用微小隐孢子虫卵囊分离自感染犊牛（来源：瑞亚牧业有限公司），HCT-8细胞系购自美国典型培养物保藏中心。

C. parvum感染调控HCT-8细胞中miR-125b-5p表达

研究团队首先检测了微小隐孢子虫感染不同时间点（3、6、12、24、48和72小时）HCT-8细胞中miR-125b-5p的表达动态。结果显示，感染早期（3-24小时）miR-125b-5p表达显著下调，而后期（48-72小时）则呈现明显上调趋势。这种时间依赖性的表达变化提示miR-125b-5p可能在不同感染阶段扮演不同角色。

miR-125b-5p调控C. parvum感染HCT-8细胞的凋亡和寄生虫负荷

为明确miR-125b-5p的功能，研究人员通过转染miR-125b-5p模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）分别上调和下调其表达。流式细胞术检测发现，过表达miR-125b-5p显著抑制了微小隐孢子虫诱导的细胞凋亡，而抑制其表达则促进凋亡。更为重要的是，这种凋亡调控与寄生虫负荷密切相关：感染12和24小时后，miR-125b-5p过表达组寄生虫负荷显著增加，而抑制组则明显减少。这一发现表明miR-125b-5p通过抑制凋亡为微小隐孢子虫的生存和繁殖创造了有利环境。

Bak1是miR-125b-5p的靶基因

通过生物信息学预测和实验验证，研究团队确认了Bcl-2家族促凋亡成员Bak1是miR-125b-5p的直接靶标。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-125b-5p可特异性结合Bak1的3'非翻译区（3'-UTR）并抑制其报告基因活性。进一步实验表明，miR-125b-5p过表达可降低Bak1的mRNA和蛋白水平，而抑制miR-125b-5p则产生相反效果。

Bak1在C. parvum诱导的HCT-8细胞凋亡中的作用

研究人员发现Bak1的表达在感染过程中也呈现时间依赖性变化，与miR-125b-5p的表达模式相反。功能实验表明，过表达Bak1促进细胞凋亡并降低寄生虫负荷，而敲低Bak1表达则抑制凋亡并增加寄生虫负荷，证实了Bak1在调控宿主细胞应答微小隐孢子虫感染中的关键作用。

miR-125b-5p通过靶向Bak1调控细胞凋亡和寄生虫负荷

为确认miR-125b-5p通过靶向Bak1发挥作用，研究团队进行了拯救实验。结果显示，共转染miR-125b-5p模拟物和Bak1过表达质粒可逆转单独转染miR-125b-5p模拟物所引起的凋亡抑制和寄生虫负荷增加，明确证实了miR-125b-5p-Bak1轴在调控宿主-寄生虫相互作用中的核心地位。

miR-125b-5p通过线粒体通路参与C. parvum感染后的细胞凋亡调控

深入机制研究表明，miR-125b-5p过表达可降低线粒体途径关键分子细胞色素c（Cytochrome c）、Caspase-9和Caspase-3的mRNA和蛋白水平，同时减轻线粒体膜电位损伤。而抑制miR-125b-5p则产生相反效果，表明其通过线粒体通路调控凋亡。

miR-125b-5p靶向Bak1通过线粒体通路调控C. parvum感染应答中的细胞凋亡

最终拯救实验证实，Bak1过表达可逆转miR-125b-5p对线粒体通路关键分子及膜电位的调控作用，完整揭示了"miR-125b-5p-Bak1-线粒体通路"在微小隐孢子虫感染中调控细胞凋亡的分子机制。

本研究系统阐明了微小隐孢子虫感染过程中miR-125b-5p通过靶向Bak1调控线粒体凋亡通路的新机制。研究发现感染早期miR-125b-5p下调允许Bak1介导的凋亡发生，可能作为宿主防御策略限制寄生虫建立感染；而感染后期miR-125b-5p上调则抑制凋亡，可能代表寄生虫的免疫逃逸机制。这种动态调控平衡了早期病原体控制与后期过度细胞死亡的关系，深化了对宿主-寄生虫共进化关系的理解。该研究不仅为隐孢子虫病的防治提供了潜在新靶点，也为其他细胞内寄生虫感染机制研究提供了重要参考。研究结果发表于《Parasites & Vectors》期刊，对推动寄生虫-宿主相互作用领域的发展具有重要意义。