四环素诱导型转基因驱动系构建显著提升斯氏按蚊产卵量并降低孵化率

《Parasites & Vectors》：Successful insertion and expression of a tetracycline transactivator in Anopheles stephensi associated with increased egg production and decreased hatching rate

本研究针对疟疾疫苗生产过程中仅需雌蚊却无法有效剔除雄蚊导致成本高昂的难题，成功构建了首个可稳定遗传的斯氏按蚊（Anopheles stephensi）四环素诱导型转基因驱动系。研究人员利用vasa启动子驱动逆转录四环素反式激活因子（rtTA）表达，通过piggyBac转座子系统获得纯合 viable 的M2i品系，该品系产卵量提升18%，但孵化率降低39%，为后续建立"雌蚊专用"疟疾疫苗生产体系奠定基础。此项突破性工作为寄生虫病防控及生物制剂低成本化生产提供了关键技术支撑。

　　

在全球传染病防控战场上，疟疾始终是悬在人类健康头顶的达摩克利斯之剑。2023年，这种由疟原虫引起的疾病仍导致2.63亿人患病和59.7万人死亡，其中绝大多数是年幼的儿童。而登革热等其他蚊媒疾病同样威胁着全球约40亿人口的生命安全。面对这一严峻挑战，Sanaria公司开创性地开发了基于纯化、无菌、瓶装冷冻保存的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）子孢子（PfSPZ）的疫苗产品。然而，疫苗生产过程中一个看似简单却成本高昂的环节成为了瓶颈——只有雌性斯氏按蚊能够携带用于疫苗生产的疟原虫子孢子，而雄性蚊子在生产过程中不仅不发挥作用，还占据了宝贵的培育空间和人力资源。

如果能实现"雌蚊专用"的疫苗生产体系，将使得在相同空间和人力投入下，疟疾疫苗的产量翻倍，从而显著降低生产成本，让更多资源有限地区的民众能够获得这一重要疫苗。为此，研究人员将目光投向了条件性基因表达系统，希望通过遗传学手段精准控制蚊子的性别比例。

本研究采用了四环素调控的转录机制，这一系统源于革兰氏阴性菌的四环素抗性机制，后经改造应用于真核生物的条件性基因表达。系统核心是逆转录四环素反式激活因子（rtTA），它能在多西环素存在时结合四环素反应元件（TRE）并启动下游基因转录。研究团队计划利用这一系统，通过建立驱动系（表达rtTA）与效应系（携带TRE调控的雄性致死基因）杂交，最终获得仅在多西环素存在时才能存活雄蚊的转基因品系。

关键技术方法包括：利用piggyBac转座子系统将vasa启动子驱动的rtTA表达框整合至斯氏按蚊基因组；通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测rtTA转录水平；采用Splinkerette PCR和全基因组测序定位转座子插入位点；通过荧光标记筛选和PCR鉴定转基因蚊子基因型；统计分析转基因品系的产卵量和孵化率评估其适应性成本。

生成斯氏按蚊驱动系，利用vasa启动子表达rtTA

研究人员最初尝试使用bZip早期胚胎启动子驱动rtTA表达，但转录水平极低。转而采用早期胚胎vasa启动子后，rtTA mRNA水平显著提升。通过胚胎显微注射piggyBac转座子系统，成功获得多个转基因品系，其中vasa启动子驱动的rtTA表达水平比bZip驱动的高出380-2326倍。

rtTA在早期胚胎vasa和bZip启动子下的转录水平

在受精后1小时收集的胚胎中检测rtTA mRNA水平，发现vasa启动子驱动的表达量显著高于bZip启动子。M2i品系的rtTA mRNA水平最高，为bZip-rtTA参照品系的2813倍，显著高于其他vasa-rtTA品系。

定位驱动构建体的转座子插入并生成纯合蚊子

通过Splinkerette PCR鉴定三个转基因品系的插入位点：M1f品系插入Era G蛋白样基因（ASTE010067）的外显子内；F2c品系插入非编码区；M2i品系插入一个推定保幼激素二醇激酶基因（ASTE000415）的内含子内。连续传代监测显示，仅M2i品系能在G17后几乎全部幼虫表达mBanana标记，而M1f和F2c品系始终只有约三分之二幼虫为转基因阳性。PCR基因分型证实M2i品系在G7时已有纯合个体，而其他两个品系直至G24仍为杂合状态。

全基因组测序进一步揭示M2i品系存在七个独立插入位点，其中六个为纯合状态，位于基因间区或内含子内，一个为杂合状态，位于未表征基因ASTE001918的外显子内。这解释了为何所有M2i幼虫均表达荧光标记但部分个体为杂合型。

评估插入相关的适应性成本

与野生型相比，纯合 viable 的M2i品系雌蚊产卵量显著增加（几何平均数181 vs 145枚），但孵化率显著降低（42% vs 76%）。F2c品系也表现出产卵量增加和孵化率降低，而M1f品系产卵量无显著变化但孵化率降低。在重复实验中，M2i品系仍保持产卵量增加（167 vs 149枚）和孵化率降低（55% vs 81%）的趋势。

研究结论与意义

本研究成功构建了首个可稳定遗传的斯氏按蚊四环素诱导型转基因驱动系M2i，实现了rtTA在vasa启动子驱动下的高效表达。该品系携带七个插入位点，其中六处为纯合且位于非编码区，表明插入未破坏必需基因功能。尽管孵化率降低约39%，但产卵量增加约18%部分抵消了这一适应性成本，总体幼虫产量减少约21%，在可接受范围内。

这一突破为后续与携带TRE调控雄性致死基因的效应系杂交奠定了基础，最终目标是建立"雌蚊专用"的疟疾疫苗生产体系，显著降低PfSPZ疫苗成本。此外，该驱动系可作为平台技术，用于在斯氏按蚊中条件性表达任何目标基因，为蚊媒疾病控制研究提供重要工具。研究还证实，转基因品系的纯合能力取决于插入位点而非rtTA表达水平，为未来类似研究提供了重要参考。该成果发表于《Parasites & Vectors》期刊，为全球疟疾防控和生物制剂低成本化生产贡献了关键技术解决方案。