时间分辨光子计数傅里叶变换显微光谱技术实现同步拉曼与荧光寿命成像

《Light-Science & Applications》：Time-resolved photon counting Fourier-transform micro-spectroscopy enables simultaneous Raman and fluorescence lifetime imaging

为解决时间门控拉曼光谱技术存在的谱范围窄、分辨率低的问题，研究人员开发了一种基于傅里叶变换光子计数光谱的技术平台。该研究通过马赫-曾德尔干涉仪与单光子雪崩二极管结合，实现了547 ps时间分辨率和0.05 cm-1光谱分辨率，在532 nm激发下覆盖-1000至10,000 cm-1拉曼位移范围。实验验证表明，该仪器能有效分离硅晶体520.7 cm-1拉曼峰与罗丹明6G的荧光信号，为生物医学成像和材料分析提供了新技术手段。

　　

当激光照射在样品上，科学家们接收到的信号往往是一场"拉曼信号"与"荧光信号"的混合交响曲。拉曼散射作为一种重要的分析工具，在材料科学、生物医学等领域发挥着关键作用，但其信号强度通常只有荧光信号的百万分之一。更棘手的是，荧光背景往往像一场喧闹的干扰音乐会，将微弱的拉曼信号完全淹没。传统的连续激光激发和检测方法无法从时间维度上区分这两种信号，因为拉曼散射是瞬时过程，而荧光则具有纳秒量级的寿命。

目前主要依靠光谱特征进行分离：荧光产生宽泛的连续谱，而拉曼散射产生离散的谱线。但这种基于光谱形状的减法方法存在明显局限——它不仅会去除密集、谱重叠的振动拉曼散射，还会保留荧光背景的光子散粒噪声，降低检测灵敏度，甚至引入系统误差。

时间门控拉曼技术通过脉冲激光和短时间门控检测，利用拉曼和荧光在时间动力学上的差异实现分离。现有技术如克尔门、门控增强型电荷耦合器件和单光子雪崩二极管各有优劣：克尔门虽能达到亚皮秒时间分辨率，但需要高脉冲能量且效率较低；ICCD的时间分辨率约为250 ps-1 ns，量子效率为1-40%；SPAD作为快速发展的单光子探测技术，成本较低但通常只能单点探测。

为解决这些技术瓶颈，尚龙东等人开发了时间分辨光子计数傅里叶变换拉曼光谱平台。该平台的核心创新在于将高精度直线电机平台的马赫-曾德尔干涉仪与光子计数雪崩二极管和时间标记采集相结合，实现了同时获取拉曼和荧光寿命图像的能力。

关键技术方法包括：1）构建傅里叶变换光谱光路系统，采用双反向移动反射镜设计使光程加倍；2）建立光子矩阵存储和处理方法，将光子事件按50 ns粗时间步长和80 ps精细时间分辨率分类；3）开发级位置实时记录和校准算法，通过532 nm单纵模连续激光校正系统误差；4）应用荧光涂层硅片和荧光塑料微球样本验证系统性能。

时间分辨光子计数傅里叶变换拉曼设置

研究团队搭建的系统采用脉冲激光（532 nm，100 ps脉冲持续时间，20 MHz重复频率），通过模式过滤和扩束后由物镜（100×/0.80 NA）聚焦到样品上。干涉仪设计采用非偏振分束器和垂直堆叠结构，使用角镜安装在直线电机平台上。系统通过双反向移动反射镜实现光程加倍和光束间对称性，提高了分辨率。同步脉冲激光信号和SPAD计数信号连接到单光子计数器，三维位移平台用于样品横向定位和聚焦。

光子信号处理与存储

研究采用时间相关单光子计数技术，将光子事件记录到光子数据矩阵中。每个光子事件用两个时间戳表征：精细时间戳（相对于最近激光脉冲信号，80 ps步长）和粗时间戳（相对于采集开始时间，50 ns步长）。在采集过程中，光子记录开始后，指令平台在定义的端点之间以恒定速度运动。恒定速度阶段提供恒定的光延迟变化时间间隔，光学延迟由粗到达时间决定，光子被添加到相应矩阵元素中。

位置记录与校准

为将时间延迟曲线转换为光谱，研究人员通过抛物线拟合中心峰确定精确零延迟t₀。对减去中值的数据进行复傅里叶变换，并通过乘以exp(iωt₀)对所得光谱进行非零零延迟位置的相位校正。为提高光学延迟精度，实时采集平台位置，使用平台的同步位置输出功能，每100 nm平台传感器位置增加（400 nm光程长度）提供1 μs持续时间的TTL脉冲。

仪器时间与光谱分辨率

仪器时间分辨率是激光时间形状、探测器时间响应函数和TCSPC的卷积。使用激光τ_l=100 ps、TCSPCτ_d=141 ps和SPADτ_s=350 ps的标称值，计算得到τ=390 ps。实验测得仪器时间分辨率为547 ps，与硬件规格估计值接近。1 mm光程长度对应±0.5 mm两干涉臂光程，提供±1.67 ps延迟，远低于仪器时间分辨率。平台70 mm行程范围提供280 mm光程长度，±467 ps延迟，标称光谱分辨率0.036 cm^-1。实验观测到的光谱半高全宽为0.05 cm^-1，接近标称值。

R6G-PVA-Si样品

对R6G-PVA-Si样品的测量显示，发射包含显著荧光信号。脉冲激光位于0 cm^-1，9398.5 cm^-1处可见峰值，对应1064 nm波长，是频率加倍前脉冲激光的残余。硅拉曼峰520.7 cm^-1在仪器时间分辨率内的零延迟附近出现。时间延迟可分为三个区域（拉曼、混合和荧光），相应光谱显示拉曼和荧光显著分离。拉曼信号与激光激发同时发生，而荧光在仪器时间分辨率内上升，随后显示约5 ns寿命的指数衰减。

PMMA-PS微珠-R6G样品

为演示系统成像能力，将两种类型的球体（PMMA和PS）与R6G混合，使得两种球体都伴有荧光背景信号。数据显示，在拉曼时间窗口内，发现两种球体的特征拉曼光谱，以及相应浓度的空间分布。5 μm珠粒大于焦深，其中心远离焦点，导致拉曼信号减少。在混合范围内，荧光强度占主导，但两种类型的球体仍可区分。在荧光范围内，拉曼信号缺失，两种类型的球体无法区分，仅检索到单个组分。

该研究开发的仪器成功解决了当前光栅型拉曼系统在光谱范围和分辨率方面的局限性，实现了基于时间动力学的拉曼和荧光分离与同步检测。平台表现出高操作稳定性和低检测限，通过高质量直线平台、位置标记记录和校准激光的位置校正，能够在50 ns时间单元中测量光子绝对到达时间的同时，记录其相对于脉冲激光源的相对定时，以80 ps时间单元测量发射动力学。仪器547 ps时间分辨率和可调光谱分辨率满足了高时间分辨率、宽光谱范围和高光谱分辨率的目标要求。

研究证实，在-1000至0 ps时间延迟范围内可获得相对纯净的拉曼信号。对表现荧光的塑料微球成像表明，通过FSC3分析可分离两种塑料类型和荧光。这种分析可通过分析光谱时间组分进一步改进，实现高保真度的拉曼和荧光组分分离。

该技术的意义不仅限于拉曼光谱学：虽然高光谱分辨率对于凝聚态物质的拉曼光谱不是必需，但在光谱学中，线宽通常由多普勒展宽决定（约0.01至0.1 cm^-1），可充分利用仪器提供的高分辨率。这种情况下，可使用1 ns脉冲的傅里叶限制谱宽0.02 cm^-1，在保持光谱分辨率的同时不受所用SPAD探测器时间分辨率的限制。

该概念可扩展到量子技术等领域，用于测量光谱和时间分辨的光子关联。仪器性能还有显著提升空间：使用超导纳米线单光子探测器可将时间分辨率提高至10 ps，相应的10 ps激发脉冲具有约2 cm^-1的变换限制线宽，仍适用于高分辨率拉曼成像。此外，可通过音圈驱动器加速延迟扫描，实现每秒100次扫描。偏振分辨率的实施对拉曼成像和量子光学应用都具有重要意义。SNSPD和宽带SPAD均可将仪器光谱检测范围扩展至近红外（>950 nm）或紫外（<400 nm），实现更广泛的科学应用。

这项发表于《Light: Science & Applications》的研究为化学分析、生物医学成像和材料表征提供了强有力的新工具，解决了长期困扰拉曼光谱技术的荧光干扰问题，开辟了时间分辨光谱检测的新途径。