综述：超越组蛋白精氨酸甲基化的CARM1多方面作用

《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Multifaceted roles of CARM1 beyond histone arginine methylation

本综述系统梳理了辅激活子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1/PRMT4）从最初作为核内表观遗传调控因子，到目前被认识到在细胞质中调控RNA加工、代谢、细胞器动力学等多重功能的研究历程。文章重点强调了CARM1新近发现的、不依赖于其催化活性的支架功能，及其通过多种翻译后修饰（PTM）和不同亚型所呈现的复杂调控网络。鉴于传统小分子抑制剂在靶向CARM1非催化功能方面的局限性，综述还展望了以蛋白降解靶向联合体（PROTAC）为代表的新一代治疗策略在癌症等疾病中的应用前景。

　　

CARM1的简史

CARM1于1999年首次被鉴定，作为一种组蛋白甲基转移酶，能与SRC-1、GRIP1/TIF2和p/CIP等辅激活子协同作用，增强核激素受体介导的转录激活。多种基因工程小鼠模型为了解其生理相关性提供了关键信息。2003年，Carm1基因敲除（KO）小鼠模型揭示了其在妊娠晚期（E18.5-E19.5）出现部分胚胎致死性，存活的胚胎表现出生长迟滞和因呼吸衰竭导致的围产期死亡。这些小鼠还在T细胞发育、脂肪生成和软骨形成方面存在缺陷，凸显了CARM1在发育中的关键作用。为了确定其酶活性的贡献，2010年创建了催化失活的Carm1敲入（KI）小鼠模型。这些酶失活的KI小鼠在很大程度上重现了完全KO模型中观察到的表型，揭示了CARM1的生物学功能主要依赖于其甲基转移酶活性。近年来，条件性基因敲除（cKO）小鼠模型被用于探索CARM1的组织特异性作用。例如，利用Pax7-Cre进行的肌肉特异性Carm1缺失表明，CARM1介导的PAX7甲基化对于卫星细胞的不对称分裂和骨骼肌再生至关重要。利用人骨骼肌肌动蛋白启动子驱动的Cre进行的后续研究表明，CARM1调节AMPK信号和自噬，从而调控肌肉质量和萎缩。在雄性生殖细胞中，通过Stra8-Cre删除Carm1揭示了其在精子细胞后期成熟中的作用，尽管其对精母细胞发育是非必需的。2019年，开发了Cre诱导的Carm1过表达模型以评估其致癌潜力。该模型显示，虽然CARM1过表达本身不会启动肿瘤发生，但它能与致癌驱动因子（如突变型ERBB2/Neu）协同作用，显著增强肿瘤进展。这些遗传模型共同为理解CARM1从组织特异性分化到肿瘤进展的多样生理和病理功能提供了关键见解，并强调了其在发育障碍和癌症中的治疗相关性。

CARM1的分子功能

尽管CARM1最初被定性为修饰组蛋白H3的转录辅激活子，但后续研究揭示了其异常广泛的底物库，涵盖了不同的细胞区室和生物学功能。与其他偏好靶向甘氨酸-精氨酸富集基序的PRMT不同，CARM1显示出独特的底物特异性，倾向于富含脯氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸区域内的精氨酸残基。这种催化活性使CARM1能够通过位点特异性甲基化来微调蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用、酶活性、蛋白质稳定性和亚细胞定位，从而精细调控细胞生理。值得注意的是，CARM1介导的甲基化的功能结果高度依赖于具体情境。在细胞核内，CARM1修饰组蛋白和非组蛋白以调节染色质可及性和转录激活；而在细胞质中，它则调控线粒体裂变、糖酵解和合成代谢。这些发现凸显了CARM1作为一种多功能酶，整合PTM信号以协调转录和代谢程序的作用。

CARM1的亚细胞定位与亚型特异性功能

CARM1在多种癌症中经常过表达，并以多种可变剪接亚型存在，每种亚型具有不同的生物学特性。两种主要亚型是全长的CARM1-FL（608个氨基酸）和缺少第15外显子的较短形式CARM1-△E15（585个氨基酸）。这些亚型在结构和功能上有所不同：CARM1-FL与肿瘤抑制活性相关，而CARM1-△E15则与致癌特性、酶活性改变以及亚细胞定位变化相关。例如，在三阴性乳腺癌中，CARM1-△E15主要位于细胞质，而CARM1-FL则主要在细胞核。在小细胞肺癌中，CARM1-FL与CARM1-△E15的比例与对化疗的不同反应相关。这些观察表明，CARM1亚型的相对丰度和定位是癌症表型和治疗反应的关键决定因素。除了CARM1-FL和CARM1-△E15，在大鼠中还发现了其他亚型，如CARM1-v2和CARM1-v3，它们由内含子保留事件产生，并表现出组织特异性表达模式。这些发现共同表明，CARM1的生物学功能高度依赖于其亚型表达和亚细胞分布。

CARM1的调控机制

CARM1的酶活性和细胞功能受到多种PTM的调控，这些修饰调节其定位、稳定性、底物特异性和催化输出。这些修饰与亚型的多样性共同定义了CARM1在生理和病理环境中的功能可塑性。

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  磷酸化： 磷酸化是CARM1的关键调控机制。在有丝分裂期间，CDK1在G2晚期磷酸化CARM1的S216，导致酶活性抑制和向细胞质的转运。进入细胞质后，CARM1进一步被PKC在S228位点磷酸化。这些事件反映了细胞周期依赖性的CARM1活性抑制的协调过程。相反，磷酸化也能增强CARM1功能。例如，PKA介导的S447磷酸化促进了与无配体的雌激素受体α（ERα）的相互作用，从而促进cAMP应答的基因表达。此外，p38γ MAPK磷酸化CARM1的S595，增强其在细胞质中的积累，这种重新定位通过减少核内PAX7甲基化并促进细胞质DRP1甲基化，改变了底物偏好。在致癌环境中，JAK2对Y149和Y334的酪氨酸磷酸化增强了CARM1的核定位和底物特异性。
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  O-连接N-乙酰葡糖胺化（O-GlcNAcylation）： CARM1受到O-GlcNAcylation的调控，这是一种营养敏感的PTM，发生在S595、S598、T601和T603位点。虽然O-GlcNAcylation不影响蛋白质稳定性或定位，但它能调节底物选择性以应对代谢应激。
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  其他修饰： GSK3β介导的T131磷酸化可防止泛素化，从而稳定CARM1蛋白水平。相反，营养充足条件下Skp2依赖的K470泛素化促进CARM1降解。R550位的自动甲基化（在致癌△E15亚型中缺失此位点）对于有效的底物结合至关重要，并调节参与转录和RNA剪接的相互作用。

通过这些组合式的PTM，CARM1在核和质功能之间切换，修改其相互作用网络，并微调其底物库。

CARM1的细胞功能

如前所述，CARM1通过其受PTM调节的底物特异性发挥多种细胞功能。在正常生理条件下，CARM1主要定位于细胞核，通过甲基化组蛋白、转录辅调节因子和参与mRNA加工的蛋白质来执行表观遗传功能。相反，一小部分CARM1定位于细胞质，参与能量代谢、细胞骨架组织、信号转导和细胞稳态维持等基本过程。然而，最近的研究表明，在病理生理条件下，CARM1会更多地易位到细胞质，异常地甲基化非核蛋白，这一事件与疾病发病机制有关。这一观点得到了三阴性乳腺癌经常过表达一种富含于细胞质的剪接变体CARM1-△E15的发现的支持。越来越多的证据表明，CARM1通过其酶活性以及非催化性的支架功能共同促进细胞稳态。

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  核功能：转录调控
  在过去的二十年中，CARM1因其在转录调控中的关键作用而被认可。CARM1介导的组蛋白精氨酸甲基化调节染色质重塑，并促进辅激活子复合物的组装，通常与组蛋白乙酰化协同作用。CBP/p300对组蛋白的预乙酰化促进了CARM1募集到染色质，增强了H3R17甲基化，并建立了转录允许的环境。从机制上讲，H3K18乙酰化通过增强甲基转移酶反应的催化效率（k_cat）来增强CARM1介导的H3R17甲基化。结构研究表明，K18乙酰化中和了相对于R17的+1位置的正电荷，从而减少了活性位点的静电干扰，促进了催化所需的质子转移。
  除了其在一般染色质调节中的作用，CARM1在多种生物学背景下控制基因特异性转录。例如，17β-雌二醇（E2）诱导CARM1募集到E2F1启动子，导致H3R17me2a增加和E2F1及其下游靶标（CDC25A, CCNA1, CCNE1, CCNE2）的转录激活，从而促进ERα阳性乳腺癌进展。类似地，在LRRFIP2变体3存在下，CARM1上调SERPINE1转录，从而促进胃癌细胞增殖。此外，CARM1通过在其启动子处沉积H3R17me2a，促进TFEB介导的自噬和溶酶体基因的转录，强调了其在响应营养匮乏时诱导自噬的关键作用。
  除了组蛋白修饰，CARM1还通过甲基化各种非组蛋白底物来调节基因表达。例如，它通过甲基化BAF155（SWI/SNF染色质重塑复合体的核心亚基）来调节c-Myc转录网络。此外，CARM1通过甲基化CBP/p300来促进BRCA1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）（CDKN1A）的转录，从而稳定BRCA1与其辅激活子之间的相互作用。CARM1依赖的NFIB-TRIM29复合物激活也被证明可驱动PDE1A转录。然而，在特定背景下，CARM1也可以作为转录抑制子发挥作用。最近的一项研究将BAP1复合物的一个组分ASXL2鉴定为CARM1的新底物。CARM1对ASXL2的甲基化阻止了MLL3募集到增强子区域，导致MLL3/COMPASS依赖性基因表达的抑制。这些发现共同表明，CARM1可以根据其修饰的特定底物及其相互作用蛋白质复合物的组成，既可作为转录辅激活子，也可作为转录辅抑制子发挥作用。
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  核功能：mRNA加工
  尽管CARM1以其在转录调控中的作用而闻名，但它也调控多种核内过程，包括RNA加工，如pre-mRNA剪接、核内mRNA输出和非编码RNA的调控。CARM1-v3亚型以不依赖于甲基化的方式，通过直接与U1 snRNP复合物组分U1C相互作用来调节5'剪接位点的选择。相比之下，CARM1-FL通过甲基化CA150和几种剪接调节因子（包括U1C, SmB, SAP49, SRSF2）来促进外显子跳跃并调节pre-mRNA剪接。通过这些活动，CARM1协调情境依赖性的可变剪接程序。
  此外，CARM1调控mRNA在核小体（paraspeckles）中的滞留——这是围绕长链非编码RNA NEAT1形成的亚核结构。具体而言，CARM1抑制NEAT1转录，从而限制核小体形成。它还甲基化p54nrb，降低其与mRNA中反向重复Alu元件（IRAlus）的亲和力。这导致含IRAlus的mRNA的核输出增强，并促进其在细胞质中的翻译。
  另外，CARM1在非编码RNA功能中扮演关键角色。CARM1介导的MED12甲基化促进了TDRD3-TOP3B复合物的募集，增强了MED12与增强子RNA（eRNA）的相互作用。这种修饰还促进了CBP/p300的募集，进而通过H3K27乙酰化激活eRNA转录。这些eRNA随后调控免疫球蛋白类别转换重组区H3K4me3的富集，从而通过募集DNA损伤和修复机制组分促进类别转换重组。
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  细胞质功能：mRNA衰变与能量代谢
  除了其明确的核功能外，CARM1也定位于细胞质，通过甲基化非组蛋白底物（如HuD, PI3KC2α, PKM2, MDH1, 核糖-5-磷酸异构酶（RPIA）和DRP1）来调节多种细胞过程。例如，CARM1敲低通过增强HuD与其3'非翻译区（3'UTR）的结合来稳定CDKN1A mRNA。同时，CARM1甲基化PI3KC2α并通过蛋白酶体-泛素化机制促进其降解，从而启动TTC5介导的微管蛋白自动调节。这些发现表明，除了核内CARM1通过无义介导的mRNA衰变途径促进mRNA降解外，细胞质CARM1也调节mRNA稳定性。
  CARM1还通过甲基化关键代谢酶来调节细胞代谢。PKM2甲基化增强其酶活性，并抑制肌醇-1,4,5-三磷酸受体（InsP3R）介导的从内质网（ER）到线粒体的钙流入，从而将能量代谢转向有氧糖酵解（即Warburg效应）。类似地，MDH1的甲基化有利于其单体、酶失活形式，导致线粒体呼吸、谷氨酰胺代谢和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）生成受损，最终破坏氧化还原稳态。值得注意的是，氧化应激动态改变CARM1的底物特异性。在氧化应激下，MDH1甲基化减少，而RPIA和DRP1甲基化增加。甲基化的RPIA通过磷酸戊糖途径增强NADPH产生，促进ROS解毒并支持细胞存活。相比之下，DRP1甲基化促进线粒体裂变并增加ROS产生，从而驱动细胞衰老。这些观察共同确立了CARM1作为一个氧化还原敏感调节器的地位，它通过在氧化应激下选择性甲基化不同底物来协调相反的细胞结局，如细胞存活与衰老。
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  非酶促的支架功能
  一些酶除了催化活性外还表现出支架功能，CARM1也不例外。尽管早期比较酶失活CARM1 KI小鼠与完全CARM1 KO模型的研究表明CARM1的生理作用是由其甲基转移酶活性介导的，但积累的证据现在支持一个双功能模型，即CARM1也发挥必需的非催化性支架作用，有助于细胞稳态。
  最初的观察表明，CARM1响应TNF和PMA/离子霉素刺激，调节几个NF-κB靶基因的表达，而不依赖于其甲基转移酶活性。虽然CARM1不影响RelA/p65向染色质的募集，但它通过稳定预起始复合物来促进转录激活，在靶基因启动子处作为促进蛋白质-蛋白质相互作用的分子支架发挥作用。
  对CARM1非催化作用的进一步机制洞察来自对ER介导转录的研究。虽然其催化活性和由此产生的H3R17甲基化对于响应雌激素的ERα-辅激活子复合物的组装是必需的，但CARM1对于cAMP信号的转录响应是可有可无的。在后一种情境下，PKA介导的S447磷酸化使CARM1能够与未配位的ERα相互作用，并作为先锋因子发挥作用，为转录激活预备染色质，此功能不依赖于其甲基转移酶活性。
  最近，CARM1的非酶功能被证实与DNA复制和细胞周期控制有关。CARM1与PARP1相互作用，并以不依赖于甲基化的方式促进复制叉处的PARylation，从而响应复制应激，促进复制叉减速和逆转。此外，CARM1作为一个核内衔接蛋白，将CDK1与Skp2/CUL-1 E3泛素连接酶复合物连接起来，促进CDK1泛素化和降解。鉴于CDK1在G2/M期转换中的关键作用，这种支架功能对细胞周期进程和细胞增殖具有重要意义。
  这些发现共同强调了CARM1作为甲基转移酶和信号网络结构协调者的多面性。这种双重功能性对治疗策略具有重要意义。

CARM1抑制剂研发现状

如上所述，CARM1的异常表达或活性与多种癌症的发生和进展有关，使其成为有吸引力的抗癌治疗靶点。因此，大量的努力被导向开发选择性的CARM1抑制剂。然而，由于体内疗效有限以及当前抑制剂无法靶向CARM1的非酶功能，其临床转化仍然受限。为了克服这些挑战，策略最近转向开发双功能抑制剂和PROTACs。

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  化学抑制剂： 自2016年以来，已开发出许多小分子CARM1抑制剂，包括SGC2085, EZM2302, TP-064, SKI-73, iCARM1和YD1342，其中几种在临床前模型中显示出抗肿瘤活性。这些抑制剂在功能上的差异可能源于它们不同的结合机制和化学结构，尽管它们都靶向CARM1的酶活性。大多数CARM1抑制剂与AdoMet或其底物竞争。SKI-73和YD1342靶向高度保守的AdoMet结合口袋，限制了其选择性。相比之下，SGC2085, EZM2302, TP-064和iCARM1结合底物结合位点，在PRMT家族中提供了更高的选择性。然而，所有已报道的CARM1抑制剂仍处于临床前阶段，作为化学探针使用，强调了为临床开发继续优化的必要性。
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  多靶点抑制剂： 考虑到表观遗传调节因子之间的功能冗余和协同作用，多靶点方法已成为有前景的治疗策略。例如，已开发出能同时抑制CARM1和CBP/p300的双重抑制剂，在多种癌细胞系中诱导凋亡。最近，CH-1被开发为同时靶向CARM1和HDAC2的双重抑制剂，在前列腺癌模型中显示出强大的体外和体内抗增殖活性。同时，泛PRMT抑制剂（如MS049和AH237）也被开发出来共同靶向CARM1和PRMT家族的其他成员。这些研究表明，基于CARM1的多靶点抑制，特别是与其他表观遗传调节因子联合，可能是比单药方法更有效的治疗策略。
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  PROTACs： 虽然传统的CARM1小分子抑制剂通过阻断其酶活性发挥作用，但关于CARM1在转录支架、蛋白质-蛋白质相互作用和染色质结构中的非催化作用的新证据表明，需要能够消除整个蛋白质的方法。因此，最近开发了靶向CARM1的PROTACs。两种PROTAC分子，CARM1降解剂-1和CARM1降解剂-2，于2023年被鉴定。它们都使用TP-064作为CARM1结合配体，连接到Von Hippel-Lindau E3连接酶配体上。这些PROTACs在处理的几小时内就能快速有效地降解CARM1。值得注意的是，CARM1降解剂-1在抑制CARM1介导的甲基化方面，其效力比TP-064强100倍以上，并且在乳腺癌细胞中以低20倍的浓度实现了相当的癌细胞迁移抑制效果。这些发现突出了PROTAC策略的治疗潜力，该策略可以同时废除CARM1的酶促和非酶促功能。

未来展望与结论

除了其作为组蛋白甲基转移酶在调控转录和染色质动力学方面已确立的核功能外，积累的证据揭示了CARM1还执行关键的非组蛋白和非核功能。这些功能包括调节RNA代谢、微管动力学以及通过甲基化参与能量代谢和细胞骨架组织的非组蛋白来维持细胞稳态。此外，CARM1独立于其酶活性发挥支架蛋白的功能，促进对细胞内信号传导和结构完整性至关重要的多蛋白复合物的组装。这些新兴作用凸显了CARM1功能的复杂性，并揭示了传统催化抑制剂的局限性，这些抑制剂无法靶向非酶促和区室特异性的功能。

CARM1在某些癌症中经常过表达，并表现出刺激依赖性的亚细胞重新定位，这可能有助于病理改变。这些观察结果表明，其酶活性过高以及CARM1的异常表达和错误定位在疾病发病机制中起着关键作用。尽管已经开发了许多选择性CARM1抑制剂并在临床前环境中进行了评估，但尚无一种进入临床试验，这意味着仅靠酶抑制可能不足以达到治疗效果。此外，不加区别地抑制CARM1的生理功能可能会导致意想不到的不良反应。

为了克服这些局限性，靶向蛋白质降解技术（如PROTACs）已成为有前景的替代方案。与催化抑制剂不同，PROTACs诱导整个CARM1蛋白的降解，从而同时废除其酶促和支架功能。例如，最近报道的一种CARM1降解剂具有破坏CARM1依赖性蛋白质复合物的能力。一个值得注意的研究方向是开发细胞器特异性的CARM1降解剂。通过选择性靶向细胞质或其他区室中的CARM1，这些策略可以在保留必要核功能的同时，解析区室化的功能。这种方法可能会扩大治疗窗口，特别是在非肿瘤性疾病中，如年龄相关疾病或代谢综合征，其中非核CARM1功能似乎具有生理相关性。

此外，合理联合治疗，共同靶向CARM1以及其他表观遗传或翻译后调节因子（如CBP/p300、PRMT5和HDACs），可能会发现合成致死性并提高治疗特异性。为了充分利用这些方法的潜力，必须更深入地了解CARM1的动态相互作用组、亚细胞分布和翻译后调控。蛋白质组学、空间组学和高分辨率成像的进步对于识别不同细胞区室和疾病状态下的特异性相互作用和功能至关重要。同时，识别CARM1依赖性的预测性生物标志物，特别是与其非催化作用相关的标志物，将对未来临床试验中的患者分层至关重要。

总之，CARM1生物学不断扩展的版图要求从传统的酶抑制转向全面的功能导向的降解策略。整合蛋白质降解技术、细胞器特异性靶向和系统水平分析，为癌症及其他疾病的下一代CARM1靶向疗法提供了一条变革性的道路。