基于活性qPCR技术快速鉴别非洲猪瘟病毒活性的方法建立与现场应用评估

《Veterinary Research》：Rapid differentiation of viable and inactivated African swine fever virus by a viability quantitative PCR

本研究针对常规qPCR无法区分非洲猪瘟病毒(ASFV)活性和灭活颗粒的技术瓶颈，建立了基于PMA/EMA染料的活性定量PCR(V-qPCR)方法。研究人员通过系统优化染料浓度、暗孵育时间和光解时间等参数，并评估表面活性剂的协同效应，成功实现了对热灭活(105℃)和化学消毒剂(PPMS、NaOH)处理ASFV的准确鉴别。在模拟环境样本(墙壁、栏杆、饲料、地板、尿液和粪便)和30份现场环境拭子验证中，该方法可靠区分了病毒活性状态，为猪场消毒效果评估和生物安全管理提供了重要技术支撑。

　　

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种高度接触性出血性传染病，对家猪和野猪具有极高致死率，急性病例死亡率接近100%。该病毒在环境中表现出极强的稳定性，其传播途径复杂多样，包括直接接触感染动物、生物媒介(软蜱)以及污染的饲料、水源、运输工具等间接传播方式。由于目前尚无安全有效的疫苗或特效药物，生物安全措施成为防控ASF的关键手段。

在ASF防控实践中，快速准确地检测病毒活性至关重要。传统的病毒分离方法虽被视为金标准，但需耗时数日且必须在生物安全三级(BSL-3)实验室条件下操作，难以满足现场快速检测的需求。实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)技术虽已广泛应用于ASFV监测，但其主要局限性在于无法区分活病毒与灭活病毒——经消毒处理后，病毒颗粒虽失去感染性，其核酸往往保持完整，导致检测结果假阳性，可能引发不必要的疫情响应和经济损失。

针对这一技术瓶颈，范高成等研究人员在《Veterinary Research》上发表了题为"Rapid differentiation of viable and inactivated African swine fever virus by a viability quantitative PCR"的研究论文，开发了一种基于核酸染料前处理的活性定量PCR(viability qPCR, V-qPCR)方法。该方法利用丙啶单氮唑(propidium monoazide, PMA)和乙啶单氮唑(ethidium monoazide, EMA)等光敏性核酸染料的选择性渗透特性：这些染料能够穿过灭活病毒受损的包膜，在光活化后与病毒DNA共价结合，从而抑制PCR扩增；而活病毒因包膜完整，染料无法进入，核酸可正常扩增。

关键技术方法包括：系统优化V-qPCR检测体系的染料浓度(0-80μM)、暗孵育时间(0-20min)和光解时间(0-20min)；评估三种表面活性剂(曲拉通X-100、吐温20、SDS)对染料穿透效果的增强作用；使用猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)培养ASFV并进行病毒滴定；采集猪场环境样本(墙壁、栏杆、饲料、地板、尿液和粪便拭子)模拟现场条件；通过热灭活(60℃、90℃、105℃)和化学消毒剂(过氧单硫酸钾PPMS、氢氧化钠NaOH、乙酸HAc)处理验证方法可靠性。

优化PMA和EMA处理条件

研究人员通过系统优化实验确定了V-qPCR的最佳工作参数。结果显示，在染料浓度5-80μM、暗处理时间0-20分钟以及光解时间10-20分钟范围内，Ct值无显著差异。基于效率和成本考量，最终选择省略暗孵育步骤，采用20μM染料浓度和15分钟光解时间进行后续研究。

表面活性剂对V-qPCR性能的影响

研究评估了三种表面活性剂(曲拉通X-100、吐温20和SDS)对V-qPCR区分活性和灭活ASFV能力的协同效应。结果表明，SDS能显著提高ΔCt值，而曲拉通X-100和吐温20影响不显著。在PMA-qPCR中，0.0001%、0.001%和0.01%SDS使Ct值分别增加4.2、7.0和8.0；EMA-qPCR对应增加值为6.5、10.0和15.7。为平衡对活病毒检测的影响和灭活病毒ΔCt值最大化，选择0.001%SDS用于后续实验。

V-qPCR的特异性和灵敏度

特异性测试表明，该方法能成功扩增ASFV DNA，且与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和非典型猪瘟病毒(APPV)无交叉反应。灵敏度实验显示，PMA-qPCR和EMA-qPCR对感染性ASFV的检测限均为10^1.5 TCID₅₀/mL。

V-qPCR检测热灭活和化学消毒剂灭活ASFV的评价

在检测60℃、90℃或105℃灭活的ASFV悬液时，染料处理样品的Ct值显著高于未处理组。PMA-qPCR的对应ΔCt值分别为3.4、4.0和4.8，EMA-qPCR为7.1、7.0和8.8，表明105℃高温灭活更适合V-qPCR检测，且EMA-qPCR对热处理ASFV的区分效果优于PMA-qPCR。

针对猪场常用消毒剂(PPMS、NaOH和HAc)灭活的ASFV，研究人员重新优化了染料浓度：PPMS灭活ASFV的最佳染料浓度为40μM(PMA)和10μM(EMA)；NaOH灭活ASFV为40μM；HAc灭活ASFV为20μM。消毒剂灭活样品经10倍PBS稀释后，EMA-qPCR对PPMS和NaOH灭活样品无扩增信号(ΔCt分别为12.3和13.1)，而对HAc灭活样品Ct值为36.9(ΔCt=10.0)。

V-qPCR在现场区分活性和灭活ASFV的性能

为评估V-qPCR在现场环境中的应用潜力，研究人员将感染性ASFV加入猪场采集的阴性环境样本(墙壁、栏杆、饲料、地板、尿液和粪便拭子)中，制备模拟ASFV阳性环境样品。检测模拟活性(未灭活)环境样品时，无论是否添加SDS，ΔCt值均小于2.5。

对于105℃灭活的模拟样品，与无染料对照相比，PMA-qPCR和EMA-qPCR的Ct值均显著增加(P<0.001)，ΔCt值分别为3.0-5.8和2.8-7.8。添加SDS后，ΔCt值进一步提高至7.9-13.9和4.9-12.3。PPMS灭活样品中，PMA-qPCR对墙壁、栏杆、尿液和粪便样品无扩增(ΔCt 11.6-13.1)；EMA-qPCR对尿液和粪便样品无DNA扩增(ΔCt 11.6-13.0)。NaOH灭活样品中，PMA-qPCR的ΔCt值为7.7-10.8；EMA-qPCR对墙壁和粪便样品无扩增(ΔCt 14.3和10.7)。HAc灭活样品表现最低，ΔCt值约1.9-6.1。

V-qPCR检测临床样本的评价

应用V-qPCR检测30份ASFV PCR阳性环境拭子，结果显示：21份样品无DNA扩增；6份样品在105℃处理前后Ct值相似(差异<2.5)，表明已灭活；3份样品(编号2、13和22)在热处理前检测到Ct值，热处理后无扩增，证实存在活病毒。

研究结论表明，建立的V-qPCR方法能够有效区分活性和灭活ASFV，特别适用于监测经高温(105℃)、PPMS或NaOH灭活的现场样本。考虑到猪场消毒策略的多样性和环境基质的复杂性，建议同时应用PMA-qPCR和EMA-qPCR进行综合临床和现场诊断。该研究首次将V-qPCR技术应用于现场评估ASFV感染性，为猪场常规消毒策略效果评估提供了实用工具，对提高ASF诊断准确性和生物安全管理水平具有重要意义。