基于集成虚拟筛选策略发现治疗白血病的天然BCL-2抑制剂及其作用机制研究

《BMC Pharmacology and Toxicology》：Identification of potential natural BCL-2 inhibitors for leukemia through an integrated virtual screening approach

本研究针对BCL-2过表达导致的白血病细胞凋亡抵抗问题，采用集成计算药物发现方法，从407,270个天然化合物中筛选出CNP0237679和CNP0420384两个先导化合物。研究通过药效团建模、分子对接、MM-GBSA结合自由能计算、DFT分析和分子动力学模拟等多项技术，证实这两个化合物与BCL-2蛋白具有强结合亲和力、良好药代动力学特性和低毒性特征，为开发新型天然来源BCL-2抑制剂提供了重要候选分子。

　　

白血病作为一种恶性血液肿瘤，在全球范围内造成沉重的疾病负担。据统计，2020年全球新增白血病病例约47.5万例，相关死亡病例达31.1万例。在这种严峻形势下，BCL-2蛋白的过表达成为约70%淋巴恶性肿瘤的关键致病机制，使其成为白血病治疗的重要靶点。

尽管FDA于2016年批准了 Venetoclax 作为选择性BCL-2抑制剂用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓系白血病(AML)，但该药物存在胃肠道副作用、中性粒细胞减少、体内稳定性差、口服生物利用度低以及成本高昂等局限性。传统药物研发过程通常需要超过26亿美元和12-14年时间，这种高成本长周期的模式难以满足临床迫切需求。

天然产物因其化学多样性和生物活性而成为药物发现的重要来源。然而，先前识别潜在BCL-2抑制剂的研究通常局限于单个数据库，而本研究使用的COCONUT数据库整合了53个数据库和文献来源的数据，为发现提供了更广泛的化合物选择。

在这项发表于《BMC Pharmacology and Toxicology》的研究中，Uddalak Das等研究人员采用集成计算方法筛选了407,270个天然化合物，旨在发现新型BCL-2抑制剂，以解决现有抑制剂的局限性，为白血病及其他BCL-2相关癌症提供新的治疗选择。

研究人员采用了几项关键技术方法：从COCONUT数据库获取407,270个天然化合物，通过Lipinski五规则筛选获得276,409个化合物；基于已知BCL-2抑制剂构建药效团模型并进行验证；使用BCL-2蛋白晶体结构(PDB ID: 6O0K)进行分子对接；通过MM-GBSA计算结合自由能；利用密度泛函理论(DFT)分析电子特性；建立QSAR模型预测IC₅₀值；评估药代动力学和毒性特征；进行100 ns分子动力学模拟分析复合物稳定性。

BCL-2蛋白和结构评估

BCL-2作为细胞凋亡的关键调节因子，包含四个保守的BCL-2同源(BH)结构域：BH1、BH2、BH3和BH4。其中BH3结构域是凋亡调节的核心，作为BCL-2结合并隔离BAX和BAK等促凋亡蛋白的活性位点。研究人员通过PDBsum网络服务器分析发现，BCL-2结构包含9个α-螺旋、3个β-发夹和3个β-转角，拉曼图显示94.4%的氨基酸残基位于优选区域，整体G因子为0.23，表明蛋白结构质量良好。

药效团模型和验证

生成的药效团模型基于PhaseHypo评分进行评估，其中AHHRR_1模型获得最高评分1.424，包含一个氢键受体(A)、两个芳香环(R)和两个疏水(H)特征。该模型生存得分为7.069，BEDROC得分为1.000。针对100个非活性化合物的验证显示，该模型在解耦数据集前1%中的富集因子(EF)为11.42%，接收器操作特征(ROC)曲线下面积为1.00，表明其在识别活性化合物方面具有高度统计显著性。

复合物的结合亲和力

对接评估显示前500个化合物的得分在-9.20至-5.688 kcal/mol之间。MM-GBSA结合能分析鉴定出两个先导化合物：CNP0237679的MM-GBSA ΔG_bind为-75.06 kcal/mol，对接得分为-7.993 kcal/mol；CNP0420384的MM-GBSA ΔG_bind为-71.15 kcal/mol，对接得分为-8.320 kcal/mol。相比之下，Venetoclax的对接得分为-6.793 kcal/mol，MM-GBSA ΔG_bind为-62.19 kcal/mol，表明筛选出的化合物具有更强的预测结合亲和力。

分子水平相互作用分析显示，这两个化合物与BCL-2结合位点形成了有利的结合构象，涉及多种相互作用。关键相互作用残基包括ASN143、ARG146、TYR108、PHE104、ASP111和GLU136，这些残基对稳定抑制剂在BCL-2口袋中的结合至关重要。

几何优化和量子化学计算

密度泛函理论(DFT)几何优化显示五个主要化合物具有稳定的分子构型。前沿分子轨道(FMO)分析评估了电子特性，CNP0237679的HOMO(最高占据分子轨道)值为-0.19883 kcal/mol，LUMO(最低未占分子轨道)值为0.14305 kcal/mol，带隙为0.34188 kcal/mol。CNP0420384的HOMO值为-0.22082 kcal/mol，LUMO值为-0.04473 kcal/mol，带隙为0.17609 kcal/mol。较小的带隙值表明这些化合物具有较高的反应活性。

量子化学描述符显示，CNP0237679的全局硬度(η)为0.071525 kcal/mol，全局软度(σ)为13.980 kcal/mol^-1，电负性(χ)为0.127305 kcal/mol，亲电性指数(ω)为0.1133 kcal/mol。CNP0420384的相应值分别为0.088045 kcal/mol、11.358 kcal/mol^-1、0.132775 kcal/mol和0.1001 kcal/mol。CNP0237679的较高偶极矩(7.76 D)可能有助于在活性位点内形成更强的氢键相互作用。

QSAR模型和预测活性

在十个领先的QSAR模型中，Kernel Partial Least Squares(KPLS)_Dendritic_1模型被确定为最准确模型，其R²值为0.8997，标准偏差(SD)为0.0022，均方根误差(RMSE)为0.0021，Q²值为0.8977。该模型用于估算筛选化合物的IC₅₀值，评估的61个化合物的IC₅₀值在0.0287 nM至0.0447 nM之间。两个排名最高的化合物CNP0237679和CNP0420384的预测IC₅₀值分别为0.0363 nM和0.0382 nM，低于中心趋势IC₅₀值。

药代动力学和毒性分析

CNP0237679和CNP0420384通过了安全性评估，显示出良好的ADME(吸收、分布、代谢、排泄)特性。两种化合物均表现出高肠道吸收和口服吸收，表明具有良好的生物利用度。它们都是P-糖蛋白(P-gp)底物，但不会抑制P-gp，减少了药物相互作用的可能性。CNP0420384具有广泛的组织分布，而CNP0237679具有较高的血脑屏障(BBB)通透性，可能在中枢神经系统靶向治疗中具有潜力。两种化合物均与血浆蛋白广泛结合，分布体积表明可能具有广泛的组织相互作用。毒性分析显示CNP0237679具有更有利的毒性特征，慢性毒性和呼吸毒性低。

复合物的轨迹评估

分子动力学模拟分析了复合物的动态行为并评估了蛋白-配体相互作用的稳定性。均方根偏差(RMSD)分析显示，配体结合稳定了BCL-2的主链构象，复合物在前100 ns内达到收敛并随后保持稳定结构。均方根波动(RMSF)谱显示结合位点残基周围存在局部波动，而回转半径(Rg)表明复合物相对于未结合形式保持紧凑。溶剂可及表面积(SASA)分析反映了蛋白主链在配体结合时的构象变化。

氢键谱显示在整个轨迹中存在持续的相互作用，非共价接触(包括疏水稳定化)在25 ns间隔处保持一致。复合物的相互作用谱在整个轨迹中保持稳定。

主成分分析(PCA)显示，与未结合复合物相比，配体结合显著扩展了蛋白主链的集体运动。自由能景观(FEL)分析描述了100 ns轨迹中配体结合复合物的构象变化。配体结合期间，全局最小能量区域内的主要自由能阱发生了完全改变。此外，复合物的能量景观揭示了多个不同的最小值，每个最小值对应配体结合复合物的2-4个亚稳态结构状态，由相对较小的能垒分隔。

研究结论与意义

这项研究成功鉴定了两个天然化合物CNP0237679和CNP0420384作为潜在的BCL-2抑制剂，为靶向白血病治疗提供了新希望。通过集成计算策略，这些化合物表现出高结合亲和力、强大的结合自由能以及在BCL-2结合口袋内的结构稳定性。药代动力学和毒性分析进一步显示了有利的特性，表明这些化合物具有高生物利用度和低毒性的潜力，适合进一步的药物开发。

研究结果强调了利用全面虚拟筛选方法发现具有癌症治疗潜力的生物活性天然化合物的实用性。分子动力学模拟为蛋白-配体稳定性提供了证据，强化了这些化合物作为BCL-2抑制剂的潜在功效。此外，开发的药效团模型可能有助于识别更多的天然抑制剂，扩展用于抗凋亡靶向治疗的化合物库。

分子动力学模拟分析的稳定性可归因于筛选化合物与BCL-2的BH3结合槽的疏水相互作用，包括Phe104、Phe112、Met115、Val133、Leu137和Ala149。其中，P2口袋中的Phe104通过π-π堆积和范德华接触作为主要锚定位点，这与Venetoclax的研究一致。Phe112也强烈参与，提供显著的结合能贡献。这些化合物在该疏水表面的相互作用与现有关于BH3模拟抑制剂(如Venetoclax)的报告直接相关，并解释了在整个模拟过程中观察到的降低的灵活性、紧凑性和非共价相互作用的持续性。

自由能景观分析显示了多个不同的能量最小值，代表了亚稳态，强调了这些复合物的动态特性。CNP0237679似乎将BCL-2稳定在较少的构象状态中，而CNP0420384允许更大的构象空间探索，表明在各种BCL-2依赖性癌症中的潜在应用。这些配体的结合表明了一种"诱导契合"机制，其中蛋白构象适应以优化结合。

为了推进这项研究，未来的工作应优先包括CNP0237679和CNP0420384的体外和体内验证，以及深入的药效学分析以确认治疗效果。鉴于其独特的结合特性，这些化合物可能在其它BCL-2依赖性癌症中具有更广泛的适用性，有助于开发更具选择性和更强效的治疗剂。这项研究代表了开发天然的、靶向的BCL-2抑制剂的重要一步，强调了计算方法在加速药物发现初始阶段的重要性。