Calycosin 能抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制，并激活 RIG-I/IRF3 信号通路

《Frontiers in Veterinary Science》：Calycosin inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication and activates RIG-I/IRF3 signaling pathway

紫草素（calycosin）通过抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制、激活RIG-I/IRF3信号通路及干扰病毒组装与释放，在体外显著抑制PRRSV感染。

　　PRRSV，即猪繁殖与呼吸综合征病毒，是一种对全球养猪业构成重大威胁的病原体。该病毒属于单链正链RNA病毒，能够引起母猪的繁殖障碍以及不同年龄和性别的猪出现呼吸道症状，给畜牧业带来巨大的经济损失。PRRSV分为两个主要基因型：PRRSV-1和PRRSV-2，根据系统发育树分析，PRRSV-1可进一步划分为4个谱系，而PRRSV-2则被分为11个谱系。这种高度的遗传多样性使得现有的商业疫苗难以提供全面的保护，因此，开发新的有效抗病毒疗法成为迫切需求。

天然黄酮类化合物在抑制病毒复制方面发挥着重要作用。在本研究中，我们发现从黄芪中提取的天然活性成分——刺芒柄花素（calycosin）能够有效抑制PRRSV的复制，无论是在病毒感染前、同时还是病毒感染后加入。刺芒柄花素的抑制效果在与病毒共培养时表现得尤为显著，这表明它可能在多个病毒生命周期阶段发挥作用。此外，刺芒柄花素还能增强抗病毒免疫反应，通过提高IFN-β和ISG56的表达水平来实现。进一步研究表明，刺芒柄花素能够促进RIG-I和MAVS的表达，并诱导IRF3的磷酸化和核转位，从而激活RIG-I/IRF3信号通路。这些发现不仅揭示了刺芒柄花素在PRRSV复制中的作用，还可能为未来抗病毒策略的开发提供新的思路。

为了系统评估刺芒柄花素的抗病毒活性，我们使用了Marc-145细胞（一种对PRRSV敏感的细胞系）进行实验。首先，我们通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测了不同浓度的黄酮类化合物对Marc-145细胞的细胞毒性。结果显示，当测试浓度分别为80 μg/mL（槲皮素、异槲皮素）、40 μg/mL（山柰酚、刺芒柄花素）、100 μg/mL（黄酮醇）、5 μg/mL（芹菜素）、20 μg/mL（异黄酮）和50 μg/mL（葛根素）时，细胞活性未受到显著影响。这表明刺芒柄花素在这些浓度范围内对细胞具有较低的毒性。

随后，我们检测了这些化合物对PRRSV ORF7 mRNA和N蛋白表达水平的影响。结果表明，异槲皮素、山柰酚、黄酮醇、刺芒柄花素和异黄酮均显著降低了PRRSV ORF7的mRNA水平，而刺芒柄花素和异黄酮则显著减少了N蛋白的表达。这些发现进一步验证了刺芒柄花素的抗病毒潜力。此外，通过免疫荧光分析（IFA）也观察到刺芒柄花素在不同处理阶段对PRRSV感染的抑制效果，特别是在与病毒共培养时表现最佳。

在进一步的研究中，我们考察了刺芒柄花素对PRRSV感染各个阶段的影响。通过病毒感染结合实验，我们发现刺芒柄花素在病毒复制、组装和释放阶段表现出显著的抑制作用，而在病毒结合和进入阶段则未观察到明显影响。这表明刺芒柄花素可能主要作用于病毒复制后期的环节，而非早期的入侵过程。此外，我们还发现刺芒柄花素能够通过激活RIG-I/IRF3信号通路，增强宿主的先天免疫反应，从而抑制病毒复制。这种激活作用不仅体现在IRF3的磷酸化和核转位上，还通过提高IFN-β和ISG56的表达水平来实现。

在讨论部分，我们强调了PRRSV对全球养猪业的长期影响及其高遗传多样性带来的挑战。现有的疫苗无法完全阻止PRRSV的传播，因此，寻找新的抗病毒化合物具有重要意义。刺芒柄花素作为一种天然黄酮类化合物，已被证明对多种病毒（如柯萨奇病毒B3、人类免疫缺陷病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒）具有抗病毒活性。然而，其在PRRSV抗病毒免疫中的作用尚未完全阐明。本研究首次揭示了刺芒柄花素对PRRSV复制的抑制作用，并且其抗病毒效果与激活RIG-I/IRF3信号通路密切相关。

尽管本研究提供了刺芒柄花素在PRRSV抗病毒方面的初步证据，但仍然存在一些局限性。例如，由于刺芒柄花素的溶解度限制，无法计算其细胞毒性半数浓度（CC50）和选择性指数（SI），这在评估其治疗潜力时可能是一个障碍。此外，目前的研究仅限于体外实验，尚未涉及体内实验以评估其安全性和有效性。因此，未来的研究需要进一步探讨刺芒柄花素对其他PRRSV毒株的抑制效果，并进行体内实验以验证其作为抗病毒药物的可行性。

总的来说，本研究揭示了刺芒柄花素在抑制PRRSV复制中的多重作用机制，包括直接抑制病毒复制、组装和释放，以及通过激活宿主的先天免疫反应来增强抗病毒能力。这些发现不仅为理解刺芒柄花素的抗病毒潜力提供了新的视角，也为开发新型抗病毒策略奠定了基础。然而，为了实现其在实际应用中的价值，还需要更多的研究来验证其对其他病毒的抑制效果，并评估其在动物体内的安全性和有效性。这将有助于推动刺芒柄花素成为一种有效的抗病毒药物，广泛应用于动物疾病的预防和治疗。