基于WGCNA和机器学习方法识别和验证肠道缺血-再灌注损伤中与线粒体相关的基因

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Identification and validation of mitochondrial-related genes in intestinal ischemia-reperfusion injury based on WGCNA and machine learning

肠道缺血再灌注损伤（II/R）的线粒体相关基因（MRGs）及免疫调控网络研究。通过GEO数据库和MitoCarta3.0筛选出28个DEMRGs，结合WGCNA、PPI网络和机器学习（Lasso、逻辑回归）确定Pdk4、Yrdc、Bcl2l11、Bcl2a1d和Pmaip1为关键基因，构建诊断模型（AUC=1.0，验证AUC=0.806），并预测ABT-737和Securinine可能为治疗药物，同时揭示这些基因与免疫细胞浸润（如树突状细胞、巨噬细胞）的关联。

　　肠道缺血再灌注（II/R）损伤是导致死亡和残疾的主要原因之一，其发生机制复杂且具有高度的临床重要性。这种损伤常见于多种临床情境，如腹部血管手术、小肠移植、严重失血性休克和绞窄性肠梗阻等。II/R损伤不仅导致肠道黏膜细胞死亡和出血，还会引发全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征（MODS）。因此，深入理解II/R损伤的分子机制并发现有效的治疗靶点和生物标志物对于改善患者的预后至关重要。

### 研究背景与意义

II/R损伤涉及多种生物学过程，包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和肠道屏障功能障碍。其中，氧化应激被认为是II/R损伤的主要原因之一，其主要特征是活性氧（ROS）的过量产生，这会进一步加剧细胞损伤和组织破坏。此外，关键信号通路如Nrf2、Wnt/β-catenin和PI3K/Akt在调节II/R损伤的严重程度方面发挥着重要作用。近年来，越来越多的研究关注于通过调节线粒体功能来治疗II/R损伤。例如，二甲双胍可以减少线粒体相关膜（MAM）的形成，促进线粒体自噬以清除受损线粒体，而右美托咪定则能调节线粒体稳定性。此外，线粒体补充疗法（MRT）也被认为是一种有潜力的治疗方法，因为它可以通过移植健康的线粒体来恢复受损细胞的能量代谢功能。

尽管上述方法在II/R损伤的治疗中显示出一定的保护作用，但目前对于线粒体相关基因（MRGs）在II/R损伤发病机制中的具体作用仍不清楚。因此，寻找新的生物标志物和研究潜在的治疗策略显得尤为关键。本研究通过整合生物信息学分析和实验验证，旨在识别与线粒体功能和II/R损伤相关的枢纽基因，并探索其在免疫微环境中的作用，以期为II/R损伤的诊断和治疗提供新的理论依据。

### 研究方法与流程

本研究采用多种方法进行系统分析。首先，从基因表达数据库GEO获取了两个关键数据集：GSE96733和GSE37013。GSE96733数据集用于差异表达基因（DEGs）分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）模块筛选，而GSE37013数据集则用于进一步的验证。通过这些数据集，研究者提取了1140个MRGs，并结合DEGs筛选出差异表达的线粒体相关基因（DEMRGs）。为了进一步研究这些基因的功能，采用了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

随后，研究者构建了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，利用MCODE算法识别出具有高交互频率的枢纽基因。此外，还使用了CytoHubba插件，结合度（Degree）和最大团中心性（MCC）算法进一步筛选出枢纽基因。为了确认这些基因的表达模式，研究者还利用了机器学习方法，如Lasso回归和逻辑回归，以筛选出最相关的基因，并通过外部数据集和qRT-PCR实验验证其表达水平。

为了探讨枢纽基因与免疫浸润之间的关系，研究者使用了CIBERSORT算法分析25种不同的免疫细胞类型在II/R损伤中的变化情况。结果表明，II/R损伤样本中M2型巨噬细胞和激活的树突状细胞（DC.Activated）的比例显著增加，而未激活的树突状细胞（DC.Immature）则表现出相反的趋势。这些发现为理解II/R损伤中的免疫机制提供了新的视角。

此外，研究者还构建了环状RNA（circRNA）-微小RNA（miRNA）-信使RNA（mRNA）的调控网络，以揭示非编码RNA在II/R损伤中的潜在作用。通过预测miRNA与mRNA及circRNA之间的相互作用，研究者发现某些miRNA可能在调控凋亡途径中起到关键作用。例如，miR-124-3p能够靶向BCL2L11并与其他circRNA相互作用，从而在II/R损伤中发挥调控作用。同时，miR-15家族（miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-195-5p）表现出广泛的调控模式，与多个靶基因和circRNA相互作用，为进一步探索非编码RNA在II/R损伤中的作用提供了理论基础。

为了评估候选药物的潜在治疗效果，研究者利用DSigDB数据库预测了可能的治疗化合物，并通过分子对接模拟分析了这些化合物与关键靶蛋白的结合亲和力。结果表明，ABT-737和Securinine可能是治疗II/R损伤的潜在药物。ABT-737作为一种BH3类似物，能够抑制BCL-2蛋白家族，从而促进线粒体凋亡。Securinine则通过激活线粒体凋亡通路，抑制肿瘤生长。这两种药物在与BCL2L11的结合中表现出较高的稳定性，其结合能分别达到-7.1 kcal/mol和-5.9 kcal/mol，显示出良好的治疗潜力。

### 研究结果与发现

通过生物信息学分析和实验验证，研究者确定了五个枢纽基因：Pdk4、Yrdc、Bcl2l11、Bcl2a1d和Pmaip1。这些基因在II/R损伤样本中表现出显著的表达差异，其中Pdk4、Yrdc、Bcl2l11和Pmaip1在II/R损伤组中上调，而Bcl2a1d则在损伤组中下调。进一步的验证结果显示，这些基因的表达模式在不同时间点的II/R模型中保持一致，支持其在II/R损伤中的重要性。

构建的诊断模型（nomogram）在训练集中表现出完美的诊断性能（AUC = 1.0），而在验证集中也显示出较高的准确性（AUC = 0.806）。该模型基于五个枢纽基因，能够有效预测II/R损伤的发生。此外，研究者还通过免疫细胞浸润分析发现，M2型巨噬细胞和激活的树突状细胞与这些枢纽基因之间存在显著的正相关，而未激活的树突状细胞则与除Pmaip1以外的其他基因呈负相关。这些发现为理解II/R损伤的免疫机制提供了新的线索。

在非编码RNA调控网络的分析中，研究者发现某些miRNA可能在调控凋亡途径中起到关键作用。例如，miR-124-3p能够靶向BCL2L11并与其他circRNA相互作用，从而在II/R损伤中发挥调控作用。此外，miR-15家族的多个成员与PDK4和YRDC等枢纽基因之间存在广泛的调控关系，进一步支持了miRNA在II/R损伤中的重要性。

### 讨论与展望

尽管目前已有多种方法用于治疗II/R损伤，但仍然缺乏明确的生物标志物和有效的治疗靶点。本研究通过整合多种分析方法，成功识别了与线粒体功能和II/R损伤相关的枢纽基因，并探讨了它们在免疫微环境中的作用。这些发现不仅为II/R损伤的分子机制提供了新的见解，也为未来的治疗策略提供了潜在的靶点。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，所构建的诊断模型在训练集中表现出较高的预测准确性（AUC = 1.0），但在验证集中仅达到0.806，这可能与样本量较小有关。因此，未来的研究需要扩大样本量，并引入多时间点、多物种和临床样本的验证，以提高模型的稳定性和临床适用性。其次，本研究主要关注了II/R损伤的早期阶段（如3小时和6小时），但临床观察表明，肠道屏障功能的损伤可能在更晚的时间点才显现。因此，未来的研究应延长再灌注时间（如6小时、12小时），并结合多组学和组织学分析，以全面揭示早期分子变化与后续组织损伤之间的动态关系。

此外，尽管qRT-PCR实验验证了枢纽基因的表达水平，但目前仅限于小鼠模型。未来的研究还需要更多的体内和体外实验，以进一步探讨这些基因在II/R损伤中的具体作用机制，并探索其作为治疗靶点的可行性。通过这些努力，有望为II/R损伤的诊断和治疗提供更加全面和精确的解决方案。

### 结论

本研究通过生物信息学方法，揭示了II/R损伤与线粒体相关基因之间的密切关系，并确定了四个关键枢纽基因：Pmaip1、Bcl2l11、Yrdc和Pdk4。这些基因可能作为II/R损伤的生物标志物，帮助识别疾病状态并指导治疗策略。同时，ABT-737和Securinine被预测为可能的治疗药物，其与关键靶蛋白的结合亲和力显示出良好的治疗潜力。此外，构建的circRNA-miRNA-mRNA调控网络和免疫细胞浸润分析为理解II/R损伤的复杂机制提供了新的视角。

综上所述，本研究不仅为II/R损伤的分子机制提供了新的见解，也为未来的治疗策略和生物标志物开发奠定了理论基础。尽管存在一定的局限性，但这些发现为进一步探索II/R损伤的治疗提供了重要的方向和依据。未来的研究应继续优化模型的稳定性和临床适用性，并通过更多的实验验证，以实现从基础研究到临床应用的转化。