综述：单细胞革命在移植领域：高分辨率绘制移植物排斥、耐受和损伤图谱

《Frontiers in Immunology》：The single-cell revolution in transplantation: high-resolution mapping of graft rejection, tolerance, and injury

本综述系统阐述了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学等技术如何将移植医学从基于形态学的诊断模式推向基于精确分子特征的分子内表型分型新时代，为开发个性化免疫抑制方案、寻找新治疗靶点及实现无创诊断监测提供了前所未有的机遇。

　　

单细胞测序技术正在从根本上改变我们对移植生物学的理解，它以前所未有的高分辨率描绘着移植物排斥、免疫耐受和损伤的细胞与分子图谱。这场技术革命使我们能够超越传统显微镜和批量转录组分析的局限，深入探索决定移植物命运的复杂机制。

超越显微镜和批量转录组

传统移植术后排斥反应的诊断金标准是移植物的病理活检评估，但这种方法存在观察者间差异大、无法揭示驱动病理过程的分子和细胞机制等固有局限。批量RNA测序虽然能量化组织样本中的平均基因表达水平，但其“平均化”特性恰恰掩盖了不同细胞类型的特异性信号，尤其是那些罕见但功能强大的关键细胞亚群。单细胞测序技术的出现解决了这些难题。以scRNA-seq为代表的技术能够以无与伦比的分辨率测量单个细胞的转录组，无偏倚地识别移植物内的所有细胞类型，精确表征其活化状态和功能谱，发现批量分析中被掩盖的稀有细胞群体，并重建驱动同种免疫反应的复杂细胞间通讯网络。这不仅是分辨率的提升，更是移植免疫学概念框架的根本转变——我们的视角正从以细胞类型为中心的模式转向以细胞状态为中心的模式。

高分辨率工具箱：从单细胞到空间多组学

scRNA-seq是单细胞革命的基础，其核心目标是获取单个细胞的完整信使RNA（mRNA）信息。其工作流程通常始于将组织样本解离成单细胞悬液，随后利用微流控技术分离单个细胞。每个独立的反应单元中，细胞被裂解，其mRNA被带有poly(dT)序列的寡核苷酸捕获。关键在于这些捕获序列上的两个独特DNA条形码：细胞条形码用于识别mRNA来自哪个细胞，以及唯一分子标识符用于区分原始mRNA分子和扩增副本，从而实现基因表达的精确定量。

为了获得更完整的生物学图像，研究人员开发了多种多模态技术，如同步测量mRNA和细胞表面蛋白的CITE-seq、结合scRNA-seq同时获取T或B细胞转录组信息及其独特抗原受体序列的scTCR/BCR-seq。而基于组织解离的单细胞技术的一个共同局限是丢失了细胞在原始组织中的空间位置信息，空间转录组学技术的出现正是为了弥补这一缺失，它直接在组织切片上原位测量基因表达，并将此表达信息映射回精确的组织坐标。

这些高技术分辨率工具产生了海量的高维多模态数据集，其有效分析需要先进的计算生物学工作流程，包括细胞类型注释、不同实验数据整合以及通过分析配体-受体对共表达模式来推断细胞间通讯网络。

解构同种移植物反应：器官特异性见解

在不同器官移植领域，单细胞研究揭示了独特的病理特征和免疫学原理。

在肾脏移植中，scRNA-seq提供了排斥反应的高分辨率细胞图谱，能够清晰区分抗体介导排斥、T细胞介导排斥和慢性肾脏移植排斥中的细胞浸润模式和活化状态。一个里程碑式的发现是，排斥期间，T细胞浸润实际上由数量有限、克隆扩增的同种反应性CD8⁺ T细胞克隆主导。这些克隆即使在成功的抗排斥治疗后也能在移植物中持续存在数月，并常转变为组织驻留记忆T细胞状态，形成潜在的克隆库，可能是未来慢性或复发性排斥的根源。这为“即使组织学解决的急性排斥也是长期慢性排斥和移植物失功主要风险因素”这一临床现象提供了机制解释。对于慢性移植物功能障碍，单核RNA测序揭示了其复杂的细胞和分子基础，近端肾小管细胞被确定为纤维化的主要驱动者。此外，尿液沉淀细胞scRNA-seq可有效捕获排斥移植物内的免疫景观，关键的同种反应性T细胞克隆也能在尿液中检测到，为开发基于尿液的无创液体活检提供了概念验证。

肝脏移植因其独特的免疫特权现象而备受关注。单细胞技术发现，与功能稳定的移植物相比，发生排斥的肝移植物中CD8⁺ T_RM数量显著增加，这些细胞表现出独特的转录特征。肝移植研究呈现了一个有趣的悖论：一方面，肝脏被认为是能诱导耐受的免疫特权器官；另一方面，当肝排斥发生时，其机制与肾脏等非特权器官惊人地相似。这表明肝脏的免疫微环境并非简单的抑制状态，而是促炎和抗炎信号高度动态相互作用的场所。

心脏移植研究因空间转录组学而革新，该技术系统绘制了排斥微环境图谱，揭示传统组织学掩盖了急性细胞性、抗体介导性和混合型排斥中深刻的分子异质性。scRNA-seq进一步解构了排斥移植物中浸润细胞的异质性：内皮细胞主动上调MHC II类分子成为抗原呈递细胞加剧免疫攻击，而特化的巨噬细胞亚群驱动区域性损伤。单细胞比较耐受与排斥移植物发现巨噬细胞中的HIF-2α是移植耐受的主调控因子，细胞间通讯分析则揭示CXCR3阻断是通过破坏趋化因子驱动的炎症回路来抑制排斥的有效策略。

在肺移植中，scRNA-seq揭示了慢性肺移植物功能障碍中深刻的免疫细胞异质性。研究发现，先天样B细胞分化为表达Mzb1的浆细胞，局部产生IgG抗体，直接促进抗体介导的排斥。多组学方法表明，间充质细胞经历稳定的促纤维化重编程，驱动排斥肺中的持续性纤维化。在急性排斥中，人肺活检scRNA-seq显示细胞毒性CD8⁺ T_RM、γδ T细胞和耗竭CD8⁺ T细胞在严重急性细胞排斥期间扩增，而调节性T细胞在轻度/恢复期短暂增加。

胰岛移植面临供体胰岛质量不一致和移植后功能下降的双重挑战。单细胞技术现可通过scRNA-seq进行全面的移植前评估，精确量化功能性β细胞比例和内分泌细胞组成。机制上，移植后衰竭涉及免疫和细胞适应性过程的协同作用。同种异体排斥由上调颗粒酶B和干扰素-γ的细胞毒性CD8⁺ T细胞以及分泌CXCL9/10的促炎M1巨噬细胞驱动。同时，胰岛细胞经历致病性适应，包括抗原呈递样转化和β细胞去分化。

移植领域的普遍主题

整合各器官特异性发现，可识别出贯穿整个移植免疫学领域的普遍原则。

在排斥的细胞相互作用方面，肾脏、肝脏和心脏移植的一个共同主题是，克隆扩增的细胞毒性CD8⁺ T细胞是急性细胞排斥的核心驱动者。髓系细胞作为关键介质，通过与T细胞的相互作用维持炎症反应和T细胞活化状态。相比之下，慢性排斥的驱动因素似乎更具器官特异性。

操作耐受的签名是一个网络级的视角。操作耐受并非由单一细胞类型主导，而是多细胞、多通路协同调控网络的结果。最近对外周血单核细胞的scRNA-seq分析揭示了操作耐受的系统免疫特征，将视野从移植物内的机制扩展到全身免疫系统。

单细胞技术还以细胞分辨率绘制了初始损伤——缺血再灌注损伤的动态细胞图谱。IRI不是一个单一事件，而是一个动态过程，scRNA-seq揭示了不同细胞类型随时间如何受到影响。更重要的是，IRI不仅是短暂损伤，还可能为长期慢性病理播下种子。研究发现，急性肾损伤后出现并持续存在一种独特的、促炎和促纤维化的近端肾小管细胞状态，称为修复失败近端肾小管细胞。这些FR-PTC细胞代表从成功修复轨迹分叉出来的病理分支，为普遍的初始IRI与后期慢性纤维化发展之间提供了直接的机制联系。

从实验室到临床：挑战与未来展望

尽管单细胞技术在基础研究中取得辉煌成就，但要将其转化为常规临床工具，仍需克服一系列技术和生物信息学障碍。

技术与生物信息学壁垒包括样本处理问题，如传统组织解离方法引入的转录组人工假象，可通过使用低温活性蛋白酶或snRNA-seq来解决；区分供体与受体细胞的独特挑战；平台特异性偏差和数据整合的复杂性；以及分析海量数据集所需的计算瓶颈，研究人员需在基于代码的生态系统和图形用户界面程序之间权衡选择。

实现临床效用的路径在于将数据转化为指导临床决策的有用信息。一个关键目标是开发经过验证的无创生物标志物。尿液细胞scRNA-seq可监测肾脏排斥的发现为此提供了重要概念验证。与此同时，供体来源的细胞游离DNA已成为一种有前景的无创生物标志物。这两种技术并非竞争关系，而是高度互补，各自提供不同但同等重要的信息。未来可设想一个两步工作流程：首先使用成本较低、周转快的dd-cfDNA进行常规频繁筛查，当其水平显著升高时，则触发第二步、更详细和信息丰富的尿液scRNA-seq分析，以确定损伤的根本原因。

此外，scRNA-seq揭示了排斥并非单一疾病，而是由不同分子内表型驱动的一组异质性疾病，这为精准医疗打开了大门。未来可根据驱动特定患者排斥的细胞和分子通路个性化治疗方案，同时尝试对低风险患者减少免疫抑制剂以最小化药物毒性。单细胞分析还是药物发现的强大引擎，不仅能识别全新治疗靶点，还能通过确认其在疾病相关组织和细胞类型中的特异性表达来预测哪些药物靶点更可能在临床试验中成功。

迈向精准移植医学的新时代

单细胞技术已将我们对移植生物学的理解从低分辨率、静态的视角带入移植物微环境的高清动态图谱世界。当前，该领域正从单纯识别和分类细胞类型转向阐明导致移植物衰竭的因果机制。通过整合多组学和空间数据，我们开始理解决定移植物命运的基因调控网络、蛋白质相互作用和组织结构。

这些技术的最终希望在于其临床转化。移植医学的未来将涉及结合来自无创液体活检的单细胞数据与临床和组织学信息。这将迎来一个精准医学的新时代，其特点是预测性诊断、个性化治疗和创新疗法。尽管挑战犹存，但技术和计算方法的快速发展让我们有理由相信，在未来十年内，单细胞分析将成为移植临床医生不可或缺的工具，引领我们进入一个移植物存活率更高、受者生活质量更好的新时代。