跨膜蛋白WAI-B2通过激活自身免疫机制，赋予小麦多重抗病性

《Advanced Science》：A Transmembrane Protein WAI-B2 Confers Multiple Disease Resistance in Wheat by Activating Autoimmunity

小麦WAI-B2基因克隆及其与Hsp90/Hsp70互作及AI辅助设计新变体的研究

　　小麦（*Triticum aestivum* L.）是全球最重要的粮食作物之一，其生产常受到多种由生物亲和性病原体引起的病害威胁，包括条锈病、叶锈病、秆锈病和白粉病。识别并克隆能够提供多病害抗性的基因对于培育具有广谱抗病能力的小麦品种具有重要意义。本研究中，科学家从一种由乙基甲磺酸乙酯（EMS）诱导的小麦自体免疫突变体8P4087中克隆出一个名为*WAI-B2*的基因，并对其在多病害抗性中的作用进行了系统分析。*WAI-B2*编码一种独特的跨膜蛋白，能够增强小麦对白粉病、条锈病、叶锈病和秆锈病的抗性。进一步研究表明，*WAI-B2*与TaHsp90和TaHsp70存在相互作用，这种相互作用在细胞稳定、信号传导和程序性细胞死亡（PCD）过程中起着关键作用。通过AlphaFold 2和SWISS-MODEL预测了*WAI-B2*中最佳的氨基酸替换位点和氢键作用位点，并设计了一系列新的*WAI-B2*等位基因。这些新等位基因在*Nicotiana benthamiana*中表现出不同程度的轻微细胞死亡特性。本研究为未来利用人工智能（AI）辅助方法设计抗病作物提供了重要的理论基础和实践依据。

### 1. 小麦抗病性研究的重要性

作物病害对农业生产构成了严重威胁，直接影响粮食产量和品质。因此，培育具有高产和强抗病能力的小麦品种一直是小麦育种的核心目标。大多数植物抗病基因属于细胞内核苷酸结合富含亮氨酸重复（NLR）受体超家族，这些基因通常具有高度多态性，并且主要针对特定的病原体分离株提供抗性。然而，携带特定抗病基因的品种在大规模种植过程中容易受到方向性选择效应的影响，最终可能导致抗病性丧失。因此，实现持久的抗病性是作物改良的关键目标之一。一种可行的方法是同时引入多个抗病基因，从而培育出具有广谱抗病能力、长期抗病性的品种。

### 2. 小麦自体免疫突变体的特性

自体免疫突变体（Wheat Autoimmunity Mutants, WAI mutants）在没有病原体感染的情况下仍表现出持续的防御反应。这些突变体通常表现出类似过敏反应（HR）的特征，包括组织坏死、类病原体反应基因（PR基因）的上调以及活性氧（ROS）的爆发。WAI蛋白通常参与细胞发育、凋亡、抗逆性和抗病性相关过程，因此成为培育抗病作物的重要资源。自体免疫现象也被称为“病斑模拟”（lesion mimic），其症状类似于叶斑病，但不依赖于病原体的存在。目前已在小麦中鉴定出多个病斑模拟突变体（LMMs），其中一些表现出增强的抗病性。然而，至今为止，仅有少数LMM基因被成功克隆，如*lm34*基因，该基因编码典型的CC-NB-LRR蛋白，能够增强对白粉病的抗性。因此，深入了解WAI突变体在小麦抗病性中的作用，有助于揭示抗病机制，并为抗病育种提供新的思路。

### 3. 自体免疫突变体8P4087的表型特征

本研究中，突变体8P4087是从冬小麦品种ND399的EMS诱变群体中鉴定出的自体免疫突变体。8P4087表现出自发性叶斑形成，其细胞坏死现象从三叶期开始，逐渐扩散至整个叶片，与野生型（WT）ND399形成鲜明对比。3,3'-二氨基联苯胺（DAB）染色显示，8P4087叶片呈现深褐色至红色的染色，表明其体内H?O?积累显著高于野生型。此外，台盼蓝染色显示8P4087叶片的细胞膜通透性发生明显变化，伴随HR、PCD和ROS的过度积累。即使在无菌条件下，8P4087在MS培养基中仍表现出自发性斑点形成。与野生型相比，8P4087表现出植株高度降低、每穗粒数减少、千粒重下降和每株粒数减少，但其穗长、穗小粒数、旗叶长度和宽度无明显差异。值得注意的是，8P4087在田间条件下表现出对白粉病、条锈病和叶锈病的抗性，但对秆锈病表现出高抗性。这些表型特征表明，*WAI-B2*基因可能在调控多病害抗性方面发挥重要作用。

### 4. 基因定位与功能验证

为了进一步研究*WAI-B2*基因的遗传基础，科学家将8P4087与广泛种植的普通小麦品种Aikang 58（AK58）进行杂交，构建了一个分离群体用于遗传分析。F?代植株表现出中间表型，提示该突变可能为半显性。通过对F?代后代的遗传分析，发现自发性斑点表型由一个不完全显性基因*WAI-B2*控制。通过BSR-Seq分析，将突变基因定位到小麦4B染色体的长臂上。利用809株F?植株构建的遗传图谱，进一步将*WAI-B2*定位在一个1.17 cM的遗传区间内，对应于205 kb的基因组区域，其中包含8个潜在的蛋白质编码基因。通过另一个包含2,245株F?植株的群体，进一步缩小了物理图谱区间，最终确定*WAI-B2*位于0.11 cM的遗传区间内，对应于167 kb的基因组区域，其中包含5个潜在的基因。序列比较显示，ND399与8P4087在这些基因中仅有一个核苷酸替换（C→T），发生在*TraesCS4B01G392100*基因的第2个外显子中，导致第425位氨基酸从亮氨酸（Leu）变为苯丙氨酸（Phe）。该突变位于预测的跨膜结构域内，表明其可能影响蛋白质的功能。

为了验证*WAI-B2*基因的功能，科学家构建了一个包含*WAI-B2*基因组序列的互补载体，该载体包含2,473 bp的上游启动子区域和1,260 bp的下游序列。通过*Agrobacterium*介导的转化技术，将该载体导入小麦品种Fielder，并获得了三株转基因植株。所有携带转基因的植株均表现出自发性叶斑表型，确认了*WAI-B2*基因在调控自体免疫中的作用。此外，转基因植株在叶斑出现后，*WAI-B2*基因的表达水平显著高于野生型*WAI-B2*。这一结果表明，*WAI-B2*基因的表达不仅受到突变位点的影响，还依赖于其在细胞内的激活过程。通过qRT-PCR分析，还发现*TaPR1*基因的表达趋势与*WAI-B2*类似，进一步支持了*WAI-B2*在免疫反应中的作用。

### 5. 蛋白质亚细胞定位分析

为了进一步探究*WAI-B2*和*wai-B2*蛋白质的亚细胞定位，科学家将它们分别与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合，并在*Nicotiana benthamiana*叶片中通过农杆菌介导的转化进行共表达。共聚焦激光扫描显微镜结果显示，p35S::WAI-B2-mCherry与p35S::wai-B2-EGFP的绿色荧光与红色荧光共定位，表明Leu到Phe的突变并未改变其亚细胞定位。此外，荧光信号在细胞质中呈现点状分布，并靶向高尔基体，提示该蛋白质可能在信号传导和运输过程中发挥作用。为进一步分析跨膜区域对亚细胞定位的影响，科学家将*WAI-B2*分为两个部分：N端（1–440 aa）和C端（413–451 aa），并分别与EGFP或mCherry融合后共表达。结果显示，p35S::WAI-B2-N-mCherry与p35S::WAI-B2-EGFP共定位，而p35S::WAI-B2-C-mCherry不仅与p35S::WAI-B2-EGFP共定位，还靶向细胞膜和细胞核膜。这一发现进一步支持了*WAI-B2*作为跨膜蛋白的假设，并表明其在信号传导和细胞结构调控中的潜在作用。

### 6. *WAI-B2*与TaHsp90、TaHsp70的相互作用

为了揭示*WAI-B2*诱导HR样反应的机制，科学家进行了免疫沉淀-质谱分析（IP-MS），以确定其互作蛋白。结果表明，*WAI-B2*与两种热休克蛋白TaHsp90和TaHsp70发生相互作用。通过设计特异性引物，从8P4087中扩增出TaHsp90和TaHsp70的序列，并用于后续实验。通过亚细胞定位、荧光互补成像（LCI）和共免疫沉淀（Co-IP）实验，进一步验证了*WAI-B2*与TaHsp90和TaHsp70之间的相互作用。共表达实验显示，p35S::WAI-B2-EGFP与TaHsp70和TaHsp90标记蛋白在*N. benthamiana*叶片中呈现偶发性共定位。LCI实验进一步支持了这一相互作用，当cLuc-WAI-B2与TaHsp90-nLuc或TaHsp70-nLuc共表达时，观察到强烈的荧光信号。此外，Co-IP实验显示，WAI-B2-pS1300-EGFP和wai-B2-pS1300-EGFP能够与TaHsp90-Myc和TaHsp70-Myc发生共免疫沉淀。这些结果表明，*WAI-B2*可能通过与TaHsp90和TaHsp70的相互作用，参与植物的先天免疫和抗病反应。

### 7. *WAI-B2*同源基因的进化分析

通过比较小麦基因组中*WAI-B2*的同源基因，科学家发现存在三种不同的等位基因：Hap-1、Hap-2和Hap-3。Hap-1是唯一表现出自体免疫表型的等位基因，而Hap-2和Hap-3分别对应于田间小麦品种Fielder、Norin61、Xinong6028、Yangmai158等以及中国春（Chinese Spring）、AK58和KN9204等。在四倍体小麦中，Durum小麦Svevo和Kronos属于Hap-3，而野生二粒小麦Zavitan属于Hap-2。这表明*WAI-B2*的进化过程可能涉及不同染色体的基因变异。通过BLAST分析，科学家还发现*WAI-B2*的同源蛋白在其他物种中存在，如玉米（*Zea mays*）中的Zm00001d052636，水稻（*Oryza sativa*）中的LOC_Os11g34090.1，以及拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中的AT3G50120。这些同源蛋白均被注释为具有未知功能的跨膜蛋白，表明*WAI-B2*可能在多种生物中具有保守的结构和功能。通过构建系统发育树，科学家发现*WAI-B2*在*Poaceae*家族中具有独特的进化轨迹，显示出与拟南芥、水稻和玉米中相关蛋白较低的相似性，进一步强调其在植物抗病性中的特殊性。

### 8. 人工智能辅助的*WAI-B2*等位基因设计

为了探索*WAI-B2*的生物学功能，并评估其与EGFP融合后是否影响功能，科学家在*N. benthamiana*中进行了细胞死亡实验。结果显示，*WAI-B2-EGFP*的过表达在72小时后诱导HR样反应，而*wai-B2-EGFP*则未表现出类似表型。由于突变位点（L425F）位于亮氨酸（L424、L425、L426）的序列中，科学家设计了L424和L426位点的定向突变，生成了WAI-B2^L424F和WAI-B2^L426F等变体。这些变体在*N. benthamiana*中未诱导HR样反应，表明L425位点在*WAI-B2*的自体免疫功能中起关键作用。为了进一步研究该位点的氨基酸替换对免疫功能的影响，科学家设计了其他氨基酸替换变体，如WAI-B2^L425W、WAI-B2^L425Y和WAI-B2^L425N，并测试其在*N. benthamiana*中的细胞死亡能力。结果显示，WAI-B2^L425W和WAI-B2^L425Y引起不同程度的细胞死亡，而WAI-B2^L425D、WAI-B2^L425H和WAI-B2^L425V则未诱导HR样反应。这些结果表明，L425位点的氨基酸替换对*WAI-B2*的免疫功能具有显著影响。此外，结构预测显示，该位点的突变可能影响蛋白质的相互作用距离和氢键形成，从而改变其功能。这一发现为通过引入新的氨基酸替换来调节*WAI-B2*功能提供了理论依据。

### 9. 抗病性与产量之间的平衡

在植物育种中，抗病性与产量之间的平衡一直是一个挑战。某些广谱抗病基因虽然能提供长期抗病性，但可能导致作物生长受阻，从而影响产量。例如，水稻中的*rbl1*突变体表现出对稻瘟病和细菌病害的广谱抗性，但其产量明显下降。因此，如何在不影响产量的前提下增强抗病性成为育种研究的重要方向。本研究中，*WAI-B2*的L425F突变虽然增强了对多种病原体的抗性，但也导致了较强的HR反应，进而引发叶片坏死。科学家通过优化该位点的氨基酸替换，设计出一个较弱的等位基因WAI-B2^L425N，该变体仅在*N. benthamiana*中引起轻微的细胞死亡，表明其在抗病性与产量之间实现了更好的平衡。利用原位编辑技术，如质粒编辑（prime editing），科学家能够高效地对*WAI-B2*基因进行单碱基替换，从而开发出具有广谱抗病能力且不影响产量的新等位基因。这一方法为未来小麦抗病育种提供了新的策略，即通过精确的基因编辑技术，在不牺牲产量的前提下增强作物的抗病能力。

### 10. 实验方法与技术细节

本研究采用了多种实验方法和技术手段，以全面分析*WAI-B2*的基因功能和蛋白质特性。在植物材料与生长条件方面，8P4087突变体和ND399野生型在河北省高邑县种植，以观察其在不同环境下的表型变化。同时，Fielder和转基因植株COM-3在温室中种植，用于抗病性评估。在H?O?反应和细胞死亡检测方面，科学家使用DAB染色法检测H?O?积累，并通过台盼蓝染色法观察细胞膜通透性和细胞死亡现象。通过无菌培养技术，科学家在MS培养基中培养8P4087种子，以确保实验结果的准确性。在DNA和RNA提取方面，采用了CTAB法提取基因组DNA，并使用RNA simple Total RNA Kit提取总RNA。BSR-Seq实验通过随机选择30株自发性坏死和30株正常F?植株，构建RNA-Seq文库，并利用Illumina HiSeq 4000平台进行测序。

在分子标记设计方面，基于BSR-Seq结果，科学家筛选了目标基因组区域内的简单重复序列（SSR）、单核苷酸多态性（SNP）和插入/缺失（InDel）序列，并利用BatchPrimer3 v1.0设计PCR引物。通过分析这些标记在亲本和突变体之间的多态性，进一步确认了*WAI-B2*的基因定位。在转基因载体构建中，科学家从8P4087中克隆出*WAI-B2*的基因组片段，并将其插入到pCAMBIA1300载体中，构建互补性转基因载体。该载体通过*Agrobacterium*介导的转化技术导入Fielder，并在*N. benthamiana*中进行表达分析。

在亚细胞定位实验中，科学家将*WAI-B2*和*wai-B2*的CDS插入到pS1300-EGFP载体中，并在*N. benthamiana*中进行表达。通过共聚焦显微镜观察，发现*WAI-B2*和*wai-B2*在细胞质中呈现点状分布，并靶向高尔基体。此外，通过将*WAI-B2*分为N端和C端，并分别与EGFP或mCherry融合，科学家进一步研究了其跨膜结构域对亚细胞定位的影响。在蛋白质相互作用分析中，科学家使用LCI实验检测*WAI-B2*与TaHsp90和TaHsp70的相互作用，并通过Co-IP实验验证了这一相互作用的特异性。

在结构预测与等位基因设计方面，科学家利用SWISS-MODEL预测了*WAI-B2*的蛋白质结构，并通过PyMOL分析了关键氨基酸位点的相互作用。基于这些结构信息，科学家设计了多个*WAI-B2*等位基因变体，以改变其相互作用距离和氢键形成。这些变体在*N. benthamiana*中进行了测试，以评估其对细胞死亡的影响。通过分组分析，科学家将氨基酸分为四类：酸性、碱性、中性、非极性疏水性，并分别选择代表性氨基酸进行替换，以探索其对*WAI-B2*功能的影响。

### 11. 研究意义与未来展望

本研究不仅揭示了*WAI-B2*基因在小麦自体免疫和多病害抗性中的重要作用，还为利用人工智能辅助方法设计抗病作物提供了新的思路。通过预测蛋白质结构和设计等位基因变体，科学家能够更精准地调控基因功能，从而在不影响产量的前提下增强作物的抗病能力。这一发现为未来小麦育种提供了理论依据和技术支持，特别是在应对病原体不断变异和进化带来的挑战方面。此外，研究还强调了跨膜蛋白在植物免疫反应中的关键作用，以及Hsp90和Hsp70在调控PCD和抗病性中的重要性。这些结果有助于深入理解植物免疫机制，并为开发新型抗病育种策略奠定基础。

总的来说，本研究通过基因克隆、功能验证和人工智能辅助设计等手段，揭示了*WAI-B2*在小麦抗病性中的核心作用。这一成果不仅为小麦抗病育种提供了新的基因资源，还展示了现代生物技术在作物改良中的巨大潜力。未来，随着人工智能技术的不断发展，有望实现更加精准和高效的抗病基因设计，从而培育出既高产又抗病的小麦品种，为全球粮食安全提供有力保障。