综述：肿瘤缺氧中活性氧指南：测量与治疗意义

本综述系统阐述了肿瘤缺氧环境下活性氧（ROS）的动态相互作用、检测策略及靶向治疗前景。文章深入探讨了缺氧如何通过影响线粒体电子传递链（ETC）、NADPH氧化酶（NOX）等来源改变ROS平衡，并评估了包括荧光探针、基因编码传感器及电子顺磁共振（EPR）在内的ROS测量技术优劣。作者强调，理解缺氧与ROS的复杂关系对开发靶向氧化还原脆弱性（如NRF2、谷胱甘肽通路）的新型抗癌策略至关重要，同时指出实验设计中模拟生理氧浓度（如5% O2）的重要性以避免再氧合假象。

　　

摘要

活性氧（ROS）是一类多样性分子，既是关键的信号媒介，也是氧化应激的潜在驱动因子。在肿瘤中，ROS影响增殖、血管生成、代谢适应及治疗抵抗等核心过程。这些过程进一步受到缺氧（许多实体瘤的典型特征）的调控，缺氧可改变氧化还原平衡与细胞信号传导。ROS与缺氧间的相互作用高度动态，二者以复杂且常难以预测的方式共同塑造肿瘤行为。由于ROS的瞬时性及不同肿瘤类型中水平的变异性，准确测量ROS与肿瘤氧合仍面临重大挑战。本指南全面更新了肿瘤中ROS与缺氧的动态互作，评估了当前ROS检测策略，并讨论了靶向癌症氧化还原脆弱性的新兴疗法。

缩略语

文中系统列出了如8OHdG、BODIPY、DCFH、DHE、HIF、H₂O₂、NOX、NRF2、ROS等关键缩略语，为后续内容理解提供基础。

1 引言

组织氧合常呈异质性，实体瘤中快速细胞增殖与异常血管生成导致缺氧区域形成。缺氧深刻改变细胞生理，包括关键信号与代谢通路，并破坏氧化还原稳态——氧化与还原物种间的平衡。氧化还原反应常生成ROS，这类高活性分子既充当第二信使，也介导细胞损伤。缺氧与ROS的互作复杂且尚未完全明晰，部分归因于术语不一致、方法学局限及研究瞬时物种的内在挑战。厘清低氧条件下ROS的生成、调控及作用机制至关重要，因其影响信号转导、代谢、细胞应激及治疗应答等诸多生物学过程。

2 ROS的类型、来源与定位

ROS涵盖多种氧衍生物，包括自由基（如超氧阴离子O₂^•?）和非自由基（如H₂O₂、次氯酸HOCl、过氧亚硝酸盐ONOO^?）。不同ROS具有迥异的反应活性、半衰期与扩散能力。例如，过氧自由基与H₂O₂相对稳定（半衰期数秒至分钟），而羟基自由基（^•OH）反应性极高（半衰期不足纳秒）。特定ROS可靶向并修饰多种蛋白的活性、功能与定位，从而调控代谢酶、转录因子活性及表观遗传修饰。

ROS被抗氧化剂清除，后者包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶等酶系统及小分子清除剂。但许多小分子“抗氧化剂”（如N-乙酰半胱氨酸NAC）的作用模式远超直接清除ROS，可能通过增加细胞半胱氨酸、提升谷胱甘肽水平、调节蛋白硫醇状态及产生硫化氢等途径发挥效应，故其效果应谨慎归因。

ROS的形成位点决定其细胞效应。细胞ROS源于酶促与非酶促过程：线粒体是主要来源，电子传递链泄漏电子生成O₂^•?；过氧化物酶体通过脂肪酸氧化产生H₂O₂；内质网相关酶类在蛋白折叠中贡献ROS生成；NADPH氧化酶（NOX）在免疫应答与信号转导中产生超氧化物与H₂O₂。人类已鉴定逾40种ROS生成酶。值得注意的是，ROS水平存在性别差异，女性线粒体ROS生成低于男性，抗氧化酶水平亦较低，这与雌激素作用相关。

3 癌症缺氧下的氧化还原平衡

ROS是细胞过程的关键调节者，通过直接修饰靶蛋白（如半胱氨酸、甲硫氨酸的翻译后修饰）发挥信号功能。在低中度水平，ROS参与病原防御、细胞信号及有丝分裂应答，触发促增殖与存活通路；但当ROS超过阈值，会破坏促氧化剂与抗氧化剂间的平衡，导致氧化应激，引起DNA、脂质、蛋白质损伤，进而损害细胞功能或致细胞死亡。

癌细胞通常维持较高ROS水平，以支持促肿瘤信号，激活存活通路而不引发细胞毒性。肿瘤ROS升高的原因多样，包括致癌信号、代谢重编程、慢性炎症及肿瘤微环境（TME）生物物理特征。其中，缺氧——由紊乱血管系统与高代谢需求驱动——是ROS的强效调节因子。缺氧通过改变电子传递链动力学及削弱抗氧化防御，重塑ROS生成与清除的平衡。缺氧与ROS的互作构建了支持肿瘤进化与治疗抵抗的复杂氧化还原景观。

4 缺氧如何影响ROS？

缺氧通过稳定缺氧诱导因子（HIF）触发广泛细胞与系统应答，驱动血管生成、代谢重编程、免疫逃避及凋亡抵抗相关基因表达。缺氧对ROS水平的影响存有争议：多数研究显示缺氧增加ROS生成，尤其线粒体复合体III被认为是中度缺氧时ROS的主要来源，其产生的H₂O₂可抑制脯氨酰羟化酶（PHD），稳定HIF-1α；但也有研究指出，分离线粒体中ROS生成依赖氧气可用性，低氧反而降低ROS产出，且某些细胞类型在缺氧下未见ROS显著增加，甚至有所下降。

这种分歧源于实验条件、细胞类型及测量方法的差异。研究缺氧时需考量以下关键因素：

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  术语不清与ROS定位不明：需明确检测的ROS物种及亚细胞定位。
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  ROS检测方法的局限：常用探针（如DCFH、Amplex Red、MitoSOX）缺乏特异性，可能与其他分子（如活性硫物种）反应；更精确技术（如基因编码探针、LC-MS分析DHE氧化产物）提供更可靠数据。
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  细胞类型特异性与实验变异性：不同细胞类型耗氧率、抗氧化酶水平各异，影响ROS平衡。
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  时间变化：缺氧暴露时长与测量时机至关重要，急性缺氧可能引发瞬时ROS爆发，而慢性缺氧可能触发适应机制。
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  再氧合假象：缺氧后暴露于空气会迅速升高ROS，需使用可控缺氧工作站及可固定探针避免。
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  细胞培养中的非生理氧条件：标准培养箱（~18% O₂）远高于生理氧水平（~5% O₂），会改变ROS代谢与HIF应答。
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  培养基成分的作用：生理相关培养基可能增加呼吸活性与ROS。
  综上，ROS生成应视为背景依赖、时间动态的现象，其大小与方向受内在细胞因素与外在实验条件共同塑造。间歇性缺氧（非持续缺氧）可能促进更高ROS形成，强调在模型系统中纳入生理相关氧波动的重要性。

5 当前测量缺氧下ROS的方法有哪些？

ROS定量因半衰期短、稳态浓度低及波动快而困难。测量方法分直接与间接两种：

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  直接检测：包括荧光探针（如DCFH-DA测H₂O₂、DHE测超氧化物）、硼酸酯探针（如MitoB测H₂O₂、ONOO^?）、基因编码硫醇探针（如HyPer7、roGFP2-Orp1）及EPR波谱。荧光探针易用、高通量，但易受低氧、pH、抗氧化剂干扰且特异性差；基因编码传感器提供高时空分辨率，但需遗传操作、活体成像；EPR特异性高，但需大样本、复杂仪器。
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  间接检测：通过测量氧化损伤生物标志物反映ROS累积效应，包括脂质过氧化（如HNE、MDA、F2-IsoPs）、蛋白损伤（如蛋白羰基、半胱氨酸氧化）及核酸损伤（如8OHdG）。LC-MS是金标准，但需注意样本处理防假性氧化。
  理想探针应兼具高物种特异性、快速可逆响应、亚细胞定位、定量输出及活体适用性。当前技术各有利弊，建议采用多模式策略（如结合动态传感器与生物标志物量化）以全面捕捉缺氧下ROS行为。未来需开发在波动氧环境中可靠工作的探针及标准化校准方案。

6 如何有效靶向缺氧TME中的ROS？

调控缺氧TME中ROS水平已成为增强癌症治疗的策略，主要分两类：

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  提升ROS诱导肿瘤细胞死亡：通过直接增加ROS生成（如Anlotinib上调NOX5）或削弱抗氧化防御（如抑制NRF2、谷胱甘肽合成酶、硫氧还蛋白还原酶）。FDA批准药物（如顺铂、阿霉素）及老药新用（如Atovaquone、Papaverine）可 modulate ROS。纳米颗粒（如铁复合物、银簇Ag5）亦被探索，但部分药物在缺氧下疗效降低。
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  降低ROS阻止肿瘤进展：使用铁螯合剂（如Deferasirox）、NOX抑制剂（如GKT831）、NOS抑制剂或抗氧化剂（如高剂量维生素C对KRAS/BRAF突变细胞有选择性毒性）。但抗氧化剂效果不一，某些（如维生素E）甚至促进肿瘤生长。
  成功关键在于使治疗与缺氧癌细胞的代谢氧化还原景观精确对接。缺氧改变ROS生成与清除，故干预效果依赖氧背景。间歇性缺氧比持续缺氧产生更高ROS爆发，需区别对待。未来需结合肿瘤特异性ROS分析、模拟TME异质性的体内模型及氧化还原生物标志物开发，以实现精准治疗。

7 结论与展望

缺氧与ROS研究的分歧凸显了ROS生物学及缺氧环境的复杂性。推进该领域需优先发展缺氧下ROS精准检测方法，优化实验条件（如采用生理氧浓度、避免再氧合），并明确报告ROS物种、检测技术、氧参数及暴露时间等细节。

缺氧与氧化应激是肿瘤进展与治疗抵抗的核心。通过精进ROS检测、优化模型及开发靶向氧化还原调节疗法，将深化对癌细胞存活、增殖及耐药机制的理解。未来影像技术与生物标志物进展至关重要，最终为改善肿瘤生物学认知及治疗策略提供支持。