改进了Fmoc保护的Tn抗原的高效且可重复的合成方法

《New Journal of Chemistry》：Revised efficient and reproducible synthesis of an Fmoc-protected Tn antigen

　　在2021年，我们的研究团队报告了一种简明的Thomsen-Nouveau（Tn）抗原的合成方法。Tn抗原是一种与肿瘤相关的O-连接糖蛋白，广泛存在于多种癌症中，如乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌和前列腺癌等。然而，经过进一步研究，我们意识到在原报告中对糖苷结构的表征存在错误。我们原本预期合成的是通过醚键连接的α-异构体，但实际上形成的是含有酯键的β-异构体，并且我们错误地将其识别为α-异构体，因为其核磁共振（NMR）谱图与α-异构体非常相似。这一错误对研究结论产生了实质性影响，因此我们决定撤回原始论文，尽管其部分工作已被纳入本研究中。在本研究中，我们报告了一种新的、成功合成Tn抗原的方法，采用了不同的糖苷化条件，以确保最终产物的正确性。

Tn抗原的结构由一个α-2-脱氧-2-N-乙酰氨基-D-半乳糖（GalNAc）通过O-连接到一个丝氨酸残基上。在固相肽合成（SPPS）中，为了便于后续操作，通常需要对Tn抗原进行保护，例如使用Fmoc（9-fluorenylmethoxycarbonyl）保护的氨基和完全乙酰化的结构。这种结构（标记为1A）对于大规模合成至关重要，特别是在开发基于Tn抗原的疫苗时。然而，以往的合成方法在不同批次之间存在不一致性，且通常需要复杂的保护基策略，这不仅增加了合成步骤的数量，还降低了产率。此外，许多文献中提供的NMR数据缺乏详细的结构解析，而是引用了几十年前的实验结果，缺乏原始谱图，使得我们难以准确确认产物结构。

在本研究中，我们重新审视了原始的合成路线，并发现其存在系统性的偏差。我们采用了一种改良的糖苷化策略，使用N-Fmoc丝氨酸苯甲酸酯作为糖苷化受体，并以TMSOTf（对甲苯磺酸三甲基硅酯）作为催化剂，成功合成了Tn抗原的正确结构。这种方法不仅避免了之前所使用的复杂保护基体系，还显著提高了合成的稳定性和可重复性。通过这一路线，我们能够以更短的步骤、更高的产率和更少的杂质获得目标产物。此外，这种方法为大规模固相肽合成提供了关键的Tn抗原前体，具有良好的应用前景。

在实验过程中，我们发现原始合成方法中使用的钯催化剂（[Pd(MeCN)?][BF?]?）虽然能够促进糖苷化反应，但其反应机制并非我们最初设想的那样。我们原本认为该催化剂会通过形成一个平面的氧化碳正离子中间体（类似SN1反应机制）来实现α-异构体的选择性合成。然而，后续的NMR实验表明，我们合成的产物实际上是β-异构体，即含有酯键的糖苷。这一结论基于对异头质子（anomeric proton）的耦合分析。在1H NMR谱图中，异头质子的化学位移（5.57 ppm）与β-异构体的特征相符，而α-异构体的耦合常数（约3–4 Hz）则明显不同。此外，NOE（核磁共振去耦合效应）实验也支持这一结论，表明异头质子与C3和C5的氢原子之间存在相互作用，这种相互作用在β-糖苷中更为常见。

我们进一步通过重复Danishefsky的合成路线，确认了这一错误的来源。Danishefsky的合成方法使用了不同的保护基策略，并在关键步骤中进行了优化，使得最终产物的结构能够被准确表征。通过对比两者的NMR数据，我们发现丹尼斯的产物与我们合成的产物在结构上存在显著差异，而我们最初的产物实际上是错误的β-异构体。因此，我们对合成条件进行了调整，采用TMSOTf作为催化剂，并在糖苷化反应中使用了更合适的受体，最终成功合成了目标产物。

此外，我们还探讨了反应机制的可能变化。在原始路线中，我们假设钯催化剂会通过形成氧化碳正离子中间体来促进糖苷化反应，从而实现α-异构体的选择性合成。然而，实验结果表明，该反应可能遵循SN2机制，即亲核试剂直接攻击糖苷化供体，而无需形成中间体。这种机制的转变可能是由于钯催化剂的亲核性较弱，导致其对反应的控制不如预期。此外，我们发现，在反应过程中，丝氨酸的羧酸基团可能被部分去质子化，从而成为更有效的亲核试剂，与糖苷化供体发生反应，最终形成酯键的糖苷。

为了验证这一假设，我们对反应条件进行了进一步优化，并采用不同的催化剂和溶剂体系。最终，我们发现使用TMSOTf作为催化剂时，能够有效促进α-异构体的形成，同时避免β-异构体的生成。这一发现不仅纠正了我们之前的错误，还为未来的Tn抗原合成提供了新的思路。通过这一改进的合成路线，我们能够更高效地获得所需的Tn抗原前体，并将其用于大规模固相肽合成，从而推动相关疫苗的研发。

在合成过程中，我们还注意到一些关键的优化点。例如，在糖苷化反应中，使用较低的温度（0°C）可以有效防止过度保护基的形成，提高产物的纯度和产率。此外，我们发现使用LiBF?作为催化剂时，能够显著提高反应的效率，尤其是在某些关键步骤中。这些优化措施不仅提高了合成的可重复性，还降低了对复杂保护基策略的依赖，使得整个合成过程更加简洁和高效。

最终，我们成功合成了Fmoc-保护的Tn抗原前体（标记为1A），并对其进行了详细的结构表征。这一结构不仅符合我们对Tn抗原的预期，而且在NMR谱图中得到了充分的验证。我们还对合成过程中可能产生的副产物进行了分析，确保最终产物的纯度和稳定性。通过这一研究，我们不仅纠正了之前的错误，还为Tn抗原的合成提供了一种更可靠、更高效的路线，这将有助于推动基于Tn抗原的癌症疫苗开发。

在本研究中，我们还强调了对实验数据的严格验证的重要性。许多过去的文献中，由于缺乏详细的NMR数据解析，导致对产物结构的判断存在偏差。因此，我们在本研究中提供了完整的NMR数据，并对其进行了详细的结构分析，以确保所有关键产物和副产物的正确识别。此外，我们还通过对比不同的合成路线，验证了我们的方法在产率和纯度方面的优势。

综上所述，本研究不仅纠正了之前合成Tn抗原时的错误，还提供了一种新的、更可靠的合成方法。通过优化催化剂和反应条件，我们成功合成了Fmoc-保护的Tn抗原前体，并对其进行了全面的结构表征。这一成果将为未来的癌症疫苗研究提供重要的材料基础，并推动基于Tn抗原的免疫疗法的发展。我们希望这一研究能够为相关领域的科学家提供有价值的参考，并促进更高效的Tn抗原合成方法的探索。