原代突变小鼠肝细胞中的体外转基因啮齿动物试验与使用HPRT基因的哺乳动物细胞基因突变试验的比较

《Environmental and Molecular Mutagenesis》：The In Vitro Transgenic Rodent Assay in Primary MutaMouse Hepatocytes Compared to the Mammalian Cell Gene Mutation Assay Using the HPRT Gene

基因突变检测：比较体外转基因啮齿类动物试验（vitroTGRA）与HPRT试验。使用10种体内致突变物，发现vitroTGRA全部检出，而HPRT漏检2-AAF。基准浓度（BMC）分析显示6种化合物两者的置信区间重叠，灵敏度相当；3种化合物HPRT更敏感。8种非DNA反应物质在vitroTGRA中均为阴性，证实细胞毒性不影响突变频率评估。该研究验证了vitroTGRA作为新型体外基因突变检测方法的适用性。

　　在现代毒理学研究中，基因突变的检测已成为评估化学物质潜在危害的重要环节。为了减少动物实验的使用，同时确保检测结果的准确性和可靠性，科学家们正在探索更为高效和人道的体外检测方法。体外转基因小鼠肝细胞基因突变检测（In Vitro Transgenic Rodent Gene Mutation Assay, *vitro*TGRA）作为一种新兴的体外检测方法，被认为能够更真实地模拟体内环境，从而更准确地预测化学物质的致突变性。本文旨在通过对比*vitro*TGRA与传统的HPRT体外基因突变检测方法，探讨其在灵敏度和特异性方面的表现，并评估其在实际应用中的潜力。

### 基因突变检测的背景

在毒理学研究中，基因突变的检测主要用于评估化学物质是否具有致突变性。为了符合“3R”原则（替代、减少和优化动物实验），许多国家和国际组织正在推动使用体外实验来替代部分动物实验。例如，OECD（经济合作与发展组织）已经制定了多项体外基因突变检测的测试指南，包括细菌回复突变试验（TG 471）和哺乳动物细胞基因突变试验（TG 476）。这些试验通常在细菌或细胞系中进行，而*vitro*TGRA则是基于转基因小鼠肝细胞进行的体外检测，其原理与体内转基因小鼠基因突变试验（*vivo*TGRA）相似，但通过在体外处理细胞来替代动物实验。

### *vitro*TGRA的原理与优势

*vitro*TGRA的核心在于使用转基因小鼠的肝细胞作为检测材料。这些肝细胞不仅保留了转基因小鼠的遗传特性，还具备类似肝脏细胞的代谢能力，能够将某些化学物质转化为具有致突变性的代谢产物。这使得*vitro*TGRA能够更准确地反映体内环境下的突变情况，特别是在代谢激活的情况下。与传统的体外检测方法相比，*vitro*TGRA在检测致突变物质时，不仅能够识别出突变，还能通过细胞的代谢能力，更好地模拟体内代谢过程。

在实际操作中，*vitro*TGRA采用了一系列严格的实验步骤，包括肝细胞的分离、代谢处理、突变频率的测定等。为了确保实验的准确性，肝细胞在分离后需进行适当的培养和处理，以维持其活性和代谢能力。此外，突变频率的评估通过构建携带突变报告基因的噬菌体，利用荧光标记和流式细胞术进行分析，从而获得可靠的突变数据。

### HPRT体外检测方法的局限性

HPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）基因突变检测是目前较为成熟的一种体外检测方法。该方法通过检测HPRT基因的突变频率来评估化学物质的致突变性，通常在CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中进行。然而，HPRT方法在某些情况下存在局限性。例如，对于需要代谢激活的化学物质，CHO细胞可能无法有效转化这些物质，从而导致检测结果不准确。此外，HPRT方法对某些物质的敏感性较低，可能遗漏一些潜在的致突变物质。

在本研究中，使用HPRT方法检测了10种已知的体内致突变物质，其中9种表现出显著的突变效应，而2-AAF（2-乙酰氨基芴）则未被检测出突变。这一结果表明，HPRT方法在某些情况下可能低估了某些物质的致突变性，尤其是在需要代谢激活的物质中。相比之下，*vitro*TGRA能够正确识别所有10种致突变物质，显示出更高的灵敏度。

### 两种方法的比较

为了更全面地评估两种方法的性能，研究者选择了10种已知的体内致突变物质，并在*vitro*TGRA和HPRT方法中进行测试。结果显示，*vitro*TGRA在检测这些物质时表现优异，能够正确识别所有10种物质的致突变性，而HPRT方法则仅识别了其中的9种。这一差异可能源于*vitro*TGRA所使用的肝细胞具有更完整的代谢能力，能够有效转化某些需要代谢激活的化学物质。

此外，研究还采用了基准浓度（Benchmark Concentration, BMC）模型来进一步分析两种方法在不同浓度下的表现。对于六种在两种方法中均被检测出突变的物质，BMC的置信区间（BMC-CI）相互重叠，表明两种方法在灵敏度上具有相似性。然而，对于三种物质（CPA、EMS和4-NQO），HPRT方法的BMC-CI低于*vitro*TGRA，这可能意味着HPRT方法对这些物质的敏感性较低。这一现象可能与CHO细胞缺乏内源性代谢能力有关，而*vitro*TGRA所使用的肝细胞则具备完整的代谢系统，能够更有效地转化化学物质，从而提高检测的准确性。

### 实验设计与实施

在实验设计方面，研究者首先选择了8种非DNA反应性物质，以评估*vitro*TGRA是否受到细胞毒性的影响。这些物质在体内基因毒性试验中未表现出致突变性，但在某些体外试验中被报道能够诱导突变。实验结果显示，这些物质在*vitro*TGRA中均未诱导显著的突变频率，表明该方法在非致突变物质的检测中具有良好的特异性。同时，实验还发现，尽管细胞毒性不会直接导致突变频率的增加，但它会减少DNA的产量，从而影响突变的评估。

对于体内致突变物质的检测，研究者选择了10种已知的致突变物质，并在两种方法中进行测试。结果表明，*vitro*TGRA能够正确识别所有10种物质的致突变性，而HPRT方法则遗漏了其中一种（2-AAF）。这一结果进一步支持了*vitro*TGRA在检测致突变物质方面的优越性。此外，研究还发现，某些物质在两种方法中表现出不同的BMC-CI，这可能与它们的代谢特性和突变机制有关。

### 实验结果的分析

在实验过程中，研究者对两种方法的检测结果进行了详细的统计分析。通过使用SAS和Excel进行数据分析，研究者能够评估突变频率的变化趋势，并确定基准浓度的置信区间。结果显示，对于大多数物质，两种方法在检测突变频率时表现相似，但*vitro*TGRA在某些情况下表现出更高的灵敏度。例如，对于需要代谢激活的物质，*vitro*TGRA能够更准确地检测其致突变性，而HPRT方法则可能因缺乏代谢能力而低估其效果。

此外，研究还发现，某些物质在*vitro*TGRA中表现出更高的突变频率，这可能与肝细胞的代谢能力有关。例如，CPA、EMS和4-NQO在*vitro*TGRA中表现出更高的突变频率，而HPRT方法则未能检测到这些物质的全部致突变性。这表明，*vitro*TGRA在某些情况下能够更全面地评估化学物质的致突变性，尤其是在需要代谢激活的物质中。

### 讨论与结论

总体而言，*vitro*TGRA在检测致突变物质方面表现出较高的灵敏度和特异性。与传统的HPRT方法相比，*vitro*TGRA能够更准确地识别需要代谢激活的物质，这可能与其使用转基因小鼠肝细胞有关。这些肝细胞不仅保留了体内代谢能力，还具备完整的代谢系统，能够更有效地转化化学物质，从而提高检测的准确性。

然而，研究也指出，某些情况下，*vitro*TGRA可能不如HPRT方法敏感。例如，对于某些物质，HPRT方法的BMC-CI更低，这可能与CHO细胞的代谢能力不足有关。此外，实验还发现，细胞毒性对突变频率的检测具有一定的影响，尤其是在DNA产量较低的情况下，可能会导致突变频率的低估。因此，在使用*vitro*TGRA时，需要特别注意细胞毒性对实验结果的影响，并选择适当的浓度范围。

综上所述，*vitro*TGRA作为一种新兴的体外检测方法，具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地预测化学物质的致突变性。尽管在某些情况下，其灵敏度可能不如HPRT方法，但其在模拟体内代谢环境方面的优势，使其在实际应用中具有更大的潜力。未来的研究可以进一步优化*vitro*TGRA的实验条件，以提高其在不同化学物质中的适用性，并探索其在实际毒理学评估中的广泛应用。