综述：远红光下的光合作用——光捕获复合物的进化适应与生物工程

《FEBS Letters》：Photosynthesis under far-red light—evolutionary adaptations and bioengineering of light-harvesting complexes

本综述系统探讨了植物和藻类在远红光（FR）环境下光合作用的进化适应机制与生物工程应用，重点解析了光系统I（PSI）中超复合物（SC）内红形式（RF）色素的空间组织、分子互作及其在遮荫适应中的生态意义，为设计具有宽光谱吸收能力的高产作物提供了理论蓝图。

　　

摘要

在植物和藻类中，光合作用由光捕获蛋白内的色素网络吸收太阳光能驱动。特殊的光合复合物可拦截光合有效辐射（PAR，400–750 nm）远红光光谱对应的低能光子。这些所谓的红形式（RF）在绿色植物支系的多条谱系中被发现，形成于光系统I超复合物特定亚基内发色团空间组织的改变，并可通过其独特的红移荧光发射特征检测到。红形式使光养生物能够殖民光限制生态位，尤其是在远红光被叶片遮荫富集的环境中。蛋白质环境在决定红形式发生中起关键作用，促进叶绿素a（Chl a）分子间的强激子相互作用并促进其被低能光子激发。本综述全面介绍了真核生物中长波长驱动光合作用的进化多样性，并详细阐述了该现象的 biophysical 和 structural 决定因素。最后，讨论了如何将这些知识应用于生物技术，以设计具有拓宽光吸收和更高产量潜力的作物冠层。

缩略语

Car，类胡萝卜素；CC，核心复合物；Chl，叶绿素；Ct，电荷转移；EC，激子耦合；EET，激发能传递；FR，远红光；HOMO，最高占据分子轨道；LHCI/II，光捕获复合物I/II；LUMO，最低未占分子轨道；PAR，光合有效辐射；PSI/II，光系统I/II；R:FR，红与远红比率；RC，反应中心；RF，红形式；SC，超复合物。

引言

太阳辐射驱动将光转化为化学能的光合反应，从而支持地球生命。进化优化了光养生物的光捕获装置，使其适应陆生和水生栖息地的光谱条件。在陆地群落中，相邻植物间的遮荫强烈影响光可用性。上层冠层螯合了红光和蓝光光子，仅将1–2%的入射光合有效辐射（PAR；400–750 nm）传输到森林地表，主要包括吸收较差的绿光和远红光（FR）波长（图1A）。类似的光强梯度也存在于高密度作物单作中：封行后，顶层冠层暴露于全光照，而下层叶片则经历持续的光限制。这伴随着红与远红比率（R:FR）自上而下降低（从顶部的1.2降至土壤水平的0.1），限制了生产力。

在真核光养生物中，两个光系统[光系统I（PSI）和PSII]通过由光捕获复合物（LHC）蛋白组成的天线系统捕获光子，这些蛋白结合叶绿素（Chl）a、Chl b和叶黄素（Xan）。Chl a存在于核心复合物（CCs）和外围天线中，而Chl b仅存在于天线系统中。吸收的能量被汇入PSI和PSII的反应中心（RCs），在那里激活光化学反应，启动沿类囊体膜的线性电子流。电子传输由串联运行的PSI和PSII驱动，最终将NADP⁺还原为NADPH（图1C），并通过建立跨类囊体质子梯度维持ATP。PSI和PSII具有不同的光谱特性（图1E）：PSII主要拦截蓝光和红光光子，而PSI拥有红形式（RFs），将其光捕获能力扩展到覆盖最长的PAR波长（λ ≥ 700 nm）。PSI核心及其天线系统均表现出与PSII不同的红移吸收，这一特性继承自蓝藻祖先。高等植物的PSI天线系统（LHCI带）由两个Lhca异源二聚体组成，结合约60个Chl分子（图1F）。这些包括红形式，即强相互作用的低能Chl对，吸收超出PSI反应中心P700的能量。尽管红形式在充足阳光下仅占光子拦截的一小部分（4–5%），但在遮荫条件下对光子吸收的贡献高达40%。因此，理解红形式的结构和生物物理决定因素可能为设计用于优化利用远红光和增强高密度作物单作光合作用的光捕获系统提供蓝图。

远红光在植物生理学中的作用

绿色植物支系——或绿色谱系——出现于10亿年前（Ga）。随后见证了多细胞真核光养生物从海洋到陆地栖息地的过渡（约5亿年前，Ma），以及约1.1亿年前被子植物生物多样性的爆发。陆地殖民促使生物适应更大的环境变异性和更宽的光谱，导致光子拦截竞争。在植物中，这是通过发展复杂的冠层结构和扩展LHC库以包含优化用于远红光吸收的亚型实现的。远红光调节植物生理学的多个过程。短期而言，远红光与红光和蓝光协同驱动光合作用（爱默生增强效应），并通过LHCs的可逆翻译后修饰控制PSI与PSII激发的平衡。长期而言，对远红光的适应导致色素代谢的重编程以及叶绿体结构和光捕获装置的调整。这包括PSI/PSII化学计量和特定LHC亚型表达的变化。在更长的时间尺度上，远红光作为光形态建成信号，激活避荫生长反应。因此，在测试不同光 regime 对植物生长反应的影响时，需要仔细考虑远红光的多效性效应。

真核光养生物中红形式的存在

红形式已在大多数真核光养生物谱系的PSI超复合物（SC）中被鉴定。相比之下，在原核生物中，红形式主要源于适应远红光过程中合成的特定红移Chl类型，这些Chl被并入两个光系统的CC中。真核红形式的进化可追溯至奥陶纪-志留纪时期（约4.89–4.03亿年前），对应于维管植物的多样化和森林冠层的出现。真核红形式源于LHCI带内的色素-色素和色素-蛋白质相互作用，在几乎所有高等植物中，该带由蛋白质异源二聚体Lhca1–Lhca4和Lhca2–Lhca3组成（图1F），并在低温（77 K）下显示出约730 nm的特征性荧光发射特征。具体而言，拟南芥Lhca1–Lhca4二聚体的荧光发射在731.5 nm，而Lhca2–Lhca3发射在728.5 nm。重组（r）Lhca复合物的体外分析将红移荧光发射峰的起源定位于Lhca3（725 nm）和Lhca4（733 nm）亚基，而rLhca1和rLhca2均发射在702 nm。此外，rLhca亚基的突变分析表明，导致Lhca3和Lhca4红移荧光发射的吸收尾源于Chl对a603–a609的强激子相互作用，其中协调Chl a603的天冬酰胺（Asn）残基是关键的结构决定因素。当组装成二聚体结构并与PSI CC结合时，LHCI亚基的发射和吸收都表现出更明显的红移：Lhca3的荧光发射λ_max从725 nm移至Lhca2–Lhca3二聚体中的728.5 nm，并在完全组装的PSI–LHCI复合物中移至735 nm。这些效应源于多种因素的组合，包括色素-色素和色素-蛋白质相互作用，这些作用稳定了这些低能态。

植物进化伴随着PSI吸收不断向更长波长扩展，以及红形式从CC到外围LHCI位点的逐步迁移。在730至740 nm之间的红移发射光谱在陆地植物如烟草（茄科）、玉米（禾本科）、豌豆（豆科）、菠菜（苋科）、白鹤芋（天南星科）、孔雀竹芋（竹芋科）和大麦（禾本科）中被记录到。在水稻（禾本科）和三七（五加科）中观察到更大的位移，分别达到743 nm和747 nm，而在耐荫物种网纹草（爵床科）中，λ_max值超过748 nm。有趣的是，海草大洋波喜荡草（波喜荡草科）和节茎虾海藻（丝粉藻科）分别显示出约720 nm和723 nm的蓝移发射峰。这些物种中红形式的丧失可能源于它们在大约6000万年前返回缺乏远红光的海洋环境后选择压力的放松。此外，大多数现存苔藓（苔藓植物）的PSI–LHCI发射λ_max值在717至735 nm之间。苔藓是绿藻和陆地植物之间的进化中间体，并显示出对陆地遮荫环境的早期适应，包括独特的PSI特征。例如，在小立碗藓中，Lhca4亚基被旁系同源亚型Lhca2b取代。在Lhca2b中，Chl a603由组氨酸（His）残基协调，这可能导致其发射波长比高等植物的PSI–LHCI复合物短约10 nm。相反，在Lhca3亚基中，Chl a603像在被子植物中一样由Asn协调，表明这一特征是在适应富远红光环境期间建立的。小立碗藓的另一个特定特征是存在于PSI–LHCI–LHCII mega复合物中的Lhcb9亚基，其中Chls a603和a612均由Asn残基协调，并显示出在683至687 nm之间的发射峰。

在光合真核生物系统树更上游处观察到蓝移的PSI–LHCI荧光发射峰。例如，淡水单细胞绿藻莱茵衣藻的发射λ_max约为720 nm。在该物种中，红形式存在于外部LHCI带中，其中Lhca2、Lhca4和Lhca9亚基占据比植物Lhca3和Lhca4亚型更远离CC的位置。在这些亚基中，Chl a603通过保守的Asn残基协调；然而，它们显示出蓝移发射，峰值分别在690和717 nm附近。类似地，在海洋绿藻奥斯特球菌中，Asn残基协调Lhca5和Lhca6中的Chl a603，但它们的发射λ_max峰值在约700 nm，表明其他蛋白质特征影响它们的光谱响应。

最近，在 Eustigmatophyte Trachydiscus minutus 中描述了其他类型的红形式。在该物种中，一个由Chl a和两个Xan分子组成的簇并表现出强激子相互作用，存在于一类特定的LHC中，称为紫黄质–Chl a蛋白。此外，在 Trebouxiophyte 波发菜中，一种长波长Chl a在其PSII–LHCII中积累。这些特征需要远红光诱导Pc-frLHC基因的表达，这是一个 divergent 的LHC亚型。这种类型的适应响应在其他浮游植物类群中也有观察到，如最近报道的鞭毛虫眼虫。在这种情况下，由类群特异性远红光吸收Lhce亚型组成的五聚体复合物在低光下适应远红光后与PSI和PSII结合。最后，在一些硅藻和其他 Eustigmatophytes 中，红形式的发生似乎取决于除色素几何形状之外的其他因素，例如LHCs的Chl:类胡萝卜素比率，突显了光合作用中低能光子吸收的复杂基础。

低能吸收的原理

生物物理决定因素

Chls是四吡咯大环，整合了Mg²⁺离子、植醇链和一个特征的第五环，共同具有一个共轭键的扩展系统，负责在可见光谱的蓝色（Soret带）和红色（Q带）区域的两个主要吸收带。这些带包含独立的电子跃迁，命名为Q_y（或S₁）、Q_x（或S₂）和Soret带（S₃），它是B_x和B_y带的叠加，x和y注释表示大环平面内的偏振方向（图3A）。在Chl a中，最低（Q_y）和次低能（Q_x）吸收带拥有正交的跃迁偶极矩。这些跃迁由四轨道模型定性描述，该模型涉及两个最高占据分子轨道（HOMOs）和两个最低未占分子轨道（LUMOs）。Q_y跃迁可以表示为从HOMO到LUMO以及从HOMO?1到LUMO+1的跃迁的线性组合。相反，Q_x跃迁表示为从HOMO?1到LUMO和从HOMO到LUMO+1的跃迁的线性组合（图3C）。B_x和B_y跃迁也可以分别通过沿x轴和y轴的两个跃迁偶极矩的线性组合来表示（图3B）。

Chl结合蛋白的吸收光谱在Q_y区域（630–685 nm范围）表现出显著的异质展宽，这是由于存在不同的光谱形式，这些形式归因于Chls定位于不同的蛋白质位点。Chls a与其蛋白质环境之间的相互作用调节了色素吸收特性，与有机溶液相比。这些相互作用导致光谱展宽和它们的吸收向更长波长移动（红移）。具体而言，Q_y带从有机溶剂中的664 nm移至大多数Chl a分子结合到光系统时观察到的665–685 nm范围。邻近色素的排列可以进一步将Chl吸收位移到红色光谱中。例如，一些产生红形式的分子相互作用导致能态低于PSI RC的主要光化学陷阱。这种光谱红移源于激子耦合，其中激发态离域在两个或更多色素上。这种耦合对环境高度敏感，因此宿主蛋白质的细微结构差异可以改变色素组织的几何形状，使Chls更靠近。这增强了色素间电子转移过程的概率，使电荷转移（CT）态更加显著。由于CT态通常与Chl对的单重激发态能量接近，它们倾向于混合到激发态中。这些事件可以显著改变色素-蛋白质复合物的光谱特性，导致大的均匀展宽、斯托克斯位移和强电子-声子耦合。

激子耦合

紧密间隔的Chls可以形成分子激子，这些是涉及多于一个色素分子的激发电子态。激子能量源于单个色素激发态之间的耦合，并受其局部环境影响——包括附近的残基、蛋白质静电和介质。尽管激子是离域态，但它们的性质取决于局域激发的能量和它们之间的相互作用。

色素聚集体的电子特性通常由Frenkel激子模型描述，其中激子耦合（EC）可以分解为长程库仑贡献和与相互作用发色团之间轨道重叠相关的短程项（CT贡献）。激子模型通常忽略所有对聚集体激发态的CT贡献。这种简化是合理的，因为大多数色素间距离足够小以允许显著的EC，但又足够大以防止CT效应。通过忽略CT贡献，可以提供系统的经典解释，因为两个电荷密度之间的静电相互作用代表了耦合发色团的激发。

当相互作用能E_ab与单个色素之间的能量差成正比或超过时（即，E_ab > |E_a ? E_b|），EC变得相关。相反，当激子混合中等或最小时（即，E_ab < |E_a ? E_b|），激发主要定位于组成聚集体的一個或多个Chls上，允许F?rster方程仍然适用。这一点从观察到两个Chls之间最强的EC约为120 cm^?1，因此显著小于这些分子Q_y能级之间的能量分离（约450 cm^?1）中显而易见。ECs相当稳定，因此对内部几何和色素轨道重叠的变化不太敏感。ECs更强烈地受色素相对位置和方向的影响，因为它们由跃迁偶极矩之间的库仑耦合决定。相比之下，位点能量可以随着分子几何的微小变化而显著变化。

电荷转移

当色素靠近时，它们之间电子转移的可能性增加，使得CT态显著。这些CT态是极性的，在基态和激发态之间表现出激发态偶极矩。与CT态相关的偶极矩促进了光学跃迁与环境的（极性）声子（即振动机械能量的量子）之间的耦合，从而增强了激子-声子耦合。Stark光谱实验表明，LHCII中Chl a的激子态可能与未结合的单体Chl a的行为类似。这表明几乎没有或没有激发的离域，这在强EC的情况下是预期的。

蛋白质协调位点内色素的吸收光谱通常显示一条狭窄的零声子线，代表纯电子跃迁，以及一个宽的、蓝移的声子带，与耦合到电子跃迁的蛋白质基质的低频振动相关。有几个因素影响这些吸收带的宽度。例如，电子跃迁与色素和蛋白质环境的振动（声子）的耦合导致均匀展宽，这是温度依赖的。

相反，非均匀展宽源于蛋白质基质内的结构波动，导致光学跃迁频率的高斯分布。这种统计分布不受温度影响，但受改变色素结合位点的慢波动影响。CT耦合的大小，与分子轨道重叠程度直接相关，对于低能吸收和荧光发射特征的发生至关重要。相反，CT态的能量，显著高于激子能量，主要影响红移带的精确位置。

然而，仅EC并不能完全解释最红LHC蛋白（如Lhca4）的光谱，或与红形式相关的宽带宽。例如，LHCII的最红跃迁，具有类似的色素组织但相互作用能是Lhca4的一半（120 cm^?1 对 260 cm^?1），中心在681 nm附近。在Lhca4中，Chl a610–a611–a612和a603–a609色素簇都是红移的。然而，由于与电荷转移态混合，a603–a609簇的最低激子能级位于更远的红色光谱中。正如最近专注于Lhca4单体的量子力学/分子力学模型所表明的，CT的更大组成部分显示a603 ?? a609方向性。

激发能传递

在LHC蛋白基质内，色素创建局部漏斗，通过优先路径将吸收的能量传递到RCs。色素表现出不同的位点能量，这些能量由与邻近发色团的相互作用调节，进而控制激发能传递（EET）动力学。红形式构成比RCs更深的能量谷，影响PSI–LHCI中的EET，降低整体捕获速率。显著地，从LHCI中的红形式缓慢的能量上坡EET途径将捕获时间增加了三倍：从约22 ps到约65 ps。在具有少量但高强度红色簇的PSI天线亚基（Lhca3和Lhca4）与具有多个更高能级的红色簇的亚基（Lhca1和Lhca2）之间，在EET和捕获时间方面存在重要区别。例如，红色的Lhca3和Lhca4亚型在将能量传递到RC方面效率低于蓝色的Lhca1和Lhca2亚型（40 ps 对 10 ps），其中Lhca3贡献约40%于PSI–LHCI中增加的捕获时间，而Lhca4占60%。

在包含更多等能Chl簇的天线亚基（Lhca1和Lhca2）中，激子可以在平衡后填充几个最低能量位点。例如，Lhca1的Chl a602–a603–a609簇的最低激子能级也是红移的，尽管程度小于Lhca4的相同簇。此外，Lhca1包含额外的红形式，作为Chl a610–a611–a612簇的一部分，以及在其CC暴露侧，由Chl a606和a613–a616对组成。它们的耦合被认为有助于Lhca4的去填充，提供了一条到CC的替代EET路线。

也有人提出，低能簇可能存在于PSII天线系统（Lhcb）内。例如，在三聚体LHCII复合物内，有效的EET由红色Chl簇a610–a611–a612的存在促进。显著地，Chl a610已被确定为最红的位点，能量主要在此聚集，从而促进向其他PSII亚基和CC的功能性EET路线。另一条优先的EET路线到PSII RC涉及位于单体天线Lhcb4中的两个低能位点（a610–a611–a612/a602–a603–a609），在外部LHCII系统和CC之间的界面处创建了一个结构和能量桥（图1D，4）。相反，两个能级低于PSII RC（P680）的Chl池位于PSII CC的内部天线亚基CP43和CP47中，其特征在于分别在685 nm和695 nm的荧光发射。

结构决定因素

蛋白质配体

协调Chl a603和a612的氨基酸的身份是决定拟南芥Lhca亚基中红形式发生的关键因素（图5A）。在单体PSII天线Lhcb4中，两个His残基负责这种协调，吸收λ_max为680 nm。相反，在Lhca1和Lhca2中，Asn残基协调Chl a612而His残基协调Chl a603，λ_max移至702 nm。然而，Lhca3和Lhca4以两个Asn残基协调Chl a603和a612为特征，导致λ_max大于720 nm。在小立碗藓中，其在Lhca3中有一个Asn残基而在Lhca4中有一个His残基作为Chl a603结合残基，观察到比高等植物更小红移的发射。正如前面提到的，一些被子植物显示出不同的λ_max，尽管共享相同的Chl对配体，可能是由于跨膜螺旋的方向和局部蛋白质环境的差异，影响了结合色素之间的相互作用。因此，这些相互作用可能对红形式的发生做出比协调配体身份更重要的贡献。尽管Chl a603由Asn协调并不足以赋予显著的远红光吸收，但它在维持Chl a603和a609之间的正确几何形状方面起关键作用，这对于该簇中的强相互作用是必不可少的。实际上，当Asn被His或Gln取代时，相应的红形式丢失。

蛋白质环境

容纳Chls的蛋白质支架直接和间接影响色素吸收带的宽度。例如，环境可能包括带电残基，促进氨基酸侧链和色素功能基团之间的氢（H）键。此外，蛋白质骨架稳定色素，调节它们的相互作用，并提供适当频率的振动，桥接激子态之间的能隙，促进EET。显著地，红移Chl簇a603–a609的蛋白质环境是不同的。虽然Chl a609通过谷氨酸（Glu）协调和相邻的精氨酸（Arg）浸入带电环境中，但Chl a603主要被非极性残基包围。有人认为，靠近Lhca3的Chl a603–a609簇的庞大疏水氨基酸（苯丙氨酸-色氨酸-苯丙氨酸代替甘氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸）的存在可能有助于网纹草和其他爵床科（例如，马蓝和穿心莲）中的大红移（图5B）。这些疏水残基侧链引起的空间位阻似乎减少了Chls a603和a609的氯环之间的距离，促进了它们更强的相互作用。此外，Chl a603–a609之间的相对取向，结合环境化学和物理性质的变化，可能进一步强化这些物种中记录的红移荧光发射（图5A）。

有人提出，额外的发色团可能有助于PSI–LHCI亚基中的低能吸收。例如，基于与LHCII单体的结构同源性，额外的Chl a615（也称为a617）被分配给陆地植物的Lhca4亚基。其在豌豆PSI–LHCI SC（PDB 7DKZ）、玉米（PDB 5ZJI）和网纹草（PDB 8WGH）的结构分析中已被实验证实。然而，最近的体内突变研究排除了其直接参与红形式的形成。

一些报告表明，Chl b也可能有助于稳定Lhca4中的红形式，尽管所涉及色素的确切身份仍然未知。

正如前面提到的，一些真核微藻显示不同类型的PSII外部天线，能够进行远红光吸收。例如，淡水物种波发菜（Trebouxiophyceae）拥有一个环状十一聚体LHCII系统，由四螺旋Pc-frLHC单体组成，此外还有规范的三螺旋LHCs的三聚体排列。这些环状复合物显示围绕710 nm的红移吸收，源于Pc-frLHC亚基内强相互作用的Chl a603–a609对，负责两个Chls之间具有明显CT特征的大激发诱导永久偶极矩。此外，Chl a609似乎与邻近的Chl a708激子耦合，可能形成Chl三聚体，这为远红光吸收提供了结构基础。最后，更细微的蛋白质环境改变似乎使一些 Eustigmatophytes 中唯一的基于Chl a的LHC系统能够进行远红光吸收。

植物低能吸收的生物工程

合理的基因工程有潜力通过增强资源利用效率显著加速精英作物品种的开发。在各种性状中，光合作用是一个新兴的作物改良目标，提出了多种策略来提高阳光到生物质的转化效率。生物工程植物中的低能光子吸收可以扩大叶片的光捕获能力，从而在富含更长波长的光条件下（例如在密集冠层下）促进光合作用。理想情况下，“智能设计”的作物冠层应促进波长在其垂直剖面中的均匀分布。这可以通过调节叶角来实现，或通过降低叶片Chl含量来降低冠层光密度。或者，遮荫叶片的光捕获装置可以调整以有效利用可用光谱，特别是通过最大化拦截最红色PAR区域的光子。

独立研究表明，通过充分利用700–750 nm范围的吸收，作物的能量转换可以增强19至26%，与大多数作物物种中观察到的估计4–6%的效率相比，这是一个显著的改进。这一生物工程概念正在引起极大兴趣，可以通过多种方法实现（图6）。

一种策略涉及将红移原核Chl类型（Chl d和f）纳入真核LHC复合物，以使激发能够被比通常由Chl a和b吸收的光子能量更低的光子激发。这种方法的可行性已在体外证明，其中Chl d和f可以被纳入植物Lhca4蛋白，引起明显的红移而不损害其功能和结构完整性。此外，Chl d已成功整合到植物LHCII复合物中，产生约25 nm的吸收红移，同时保持天然蛋白质结构、EET和能量淬灭。然而，在植物中实现异源Chl生物合成的报道尚未出现，并面临至少三个主要挑战：（i）Chl d合成所需的因子尚未确定；（ii）非天然Chl类型在真核LHCs中的体内 incorporation 可能不是最优的；（iii）将低能色素插入以Chl a为主的真核LHCs可能产生能量陷阱，从而减慢EET和能量捕获，尤其是在PSII RC中。

第二种策略，旨在通过修饰蛋白质支架以创建LHCs的新光谱特性，通过工程化蛋白质支架来改变天然的色素-色素和色素-蛋白质相互作用，从而拓宽光捕获系统的吸收能力。