通过腺毛特异性工程和代谢流重定向在烟草（Nicotiana tabacum）中异源生产佛斯可林

《Plant Biotechnology Journal》：Heterologous Production of Forskolin in Tobacco (Nicotiana tabacum) via Glandular Trichome Specific Engineering and Metabolic Flux Redirection

1. 研究通过CRISPR/Cas9敲除内源CBT-Diols合成途径，并在烟草腺毛特异性表达Forskolin生物合成基因，显著提高其产量至206.33 μg/g DW，超过原生植物。该成果为可持续生产高价值天然生物活性物质提供了新策略。

　　植物作为可持续和可扩展的生物反应器，为高价值天然生物活性化合物的生产提供了广阔前景。这是因为植物能够通过其固有的光合作用碳固定机制，利用二氧化碳、光能、水和矿物质合成多种植物化学物质。然而，利用稳定转基因植物进行代谢工程时，面临异源化合物积累水平低的挑战。本研究中，我们成功地在转基因烟草中生产了 forskolin，这是一种主要存在于药用植物 Coleus forskohlii 根部的 labdane 型二萜类化合物。forskolin 通过激活环腺苷酸（cAMP）信号通路，被广泛用于治疗心脏病、呼吸系统疾病、高血压、肥胖和哮喘等病症。此外，其衍生物 NKH477 已在日本获批用于治疗严重心力衰竭，特别是 β-肾上腺素受体下调的情况。近期研究还发现 forskolin 在细胞重编程、逆转帕金森病症状以及治疗肥厚型心肌病等方面具有潜在应用价值。然而，由于其立体化学结构的复杂性，forskolin 的全化学合成仍需经过24步，产生混合的对映体。因此，目前的商业生产依赖于从 Coleus forskohlii 根部提取，而这种提取方式导致了植物的过度采集和不可持续性，使该植物面临濒危的风险。

为了实现 forskolin 的可持续生产，我们探索了通过转基因技术将 forskolin 合成路径引入烟草植物的可能性。通过转录因子的调控，我们成功地在烟草的腺毛中实现了 forskolin 的高效积累。首先，我们利用 Nicotiana benthamiana 进行瞬时表达实验，验证了 forskolin 合成路径的可行性。我们发现，将六个生物合成基因，包括二萜合酶（CfTPS2 和 CfTPS3）、细胞色素 P450（CYP76AH15、CYP76AH11 和 CYP76AH16）以及乙酰转移酶（CfACT1-8）进行共表达，能够成功合成 forskolin，并且其在烟草叶片中的积累量显著高于其在转基因烟草中的水平。接着，我们进一步通过 CRISPR/Cas9 技术敲除烟草中内源性二萜代谢途径中的 CBTS 基因家族，以减少对异源化合物合成的干扰，从而实现对代谢流的重新定向。

通过这种策略，我们不仅提高了 forskolin 在烟草叶片中的产量，还实现了其在烟草叶片中超过原生植物 Coleus forskohlii 根部的积累水平。具体来说，在转基因烟草植物中，forskolin 的含量达到了 21.26 μg/g 新鲜重量（206.33 μg/g 干重），而 Coleus forskohlii 根部的含量约为 130 μg/g 干重。这表明，烟草植物不仅可以作为高效的生物反应器，还能够通过组织或器官特异性工程和代谢流调控，显著提升高价值天然生物活性化合物的产量。这种策略不仅有助于解决传统提取方法带来的生态问题，还为未来其他天然化合物的生产提供了新的思路。

烟草作为一种快速生长的作物，其生命周期约四个月，生物量可达 170 吨/公顷。其基因组已经被广泛研究，包括其四倍体基因组及其二倍体祖先 Nicotiana sylvestris 和 Nicotiana tomentosiformis 的基因组。这使得烟草成为一种理想的代谢工程宿主，因为其具备成熟的遗传转化和基因组编辑技术。此外，烟草叶片表面富含腺毛，这些结构在二萜类化合物的合成和积累中起着关键作用。腺毛不仅能够高效地合成、分泌和储存大量二萜类化合物，如 α/β-环己烯二醇（CBT-diols），还能够提供丰富的前体物质，如 geranylgeranyl diphosphate（GGPP）。因此，利用烟草腺毛作为生物反应器，可以有效提升 forskolin 的合成效率。

在本研究中，我们通过腺毛特异性启动子驱动生物合成基因的表达，并通过 CRISPR/Cas9 敲除 CBTS 基因家族，以减少内源性 CBT-diols 的合成，从而提高 GGPP 的可用性。这种策略使得 forskolin 在烟草叶片中的产量显著提升，达到了 21.26 μg/g 新鲜重量（206.33 μg/g 干重）。同时，我们还发现，通过腺毛特异性启动子驱动的基因表达，不仅提升了 forskolin 的产量，还避免了对其他代谢途径的干扰。这一发现对于开发其他天然化合物的植物生产系统具有重要意义。

此外，我们的研究还揭示了烟草腺毛在代谢工程中的独特优势。虽然腺毛在植物整体生物量中占比较小，但它们在特定代谢途径中的活跃程度远高于其他组织。通过腺毛特异性表达系统，我们可以将生物合成基因集中表达在腺毛中，从而实现对特定化合物的高效合成。同时，通过基因编辑手段消除内源性代谢产物的干扰，可以进一步优化代谢流，提高异源化合物的合成效率。这种组织特异性工程策略不仅适用于 forskolin 的生产，也可以推广到其他天然化合物的合成中。

本研究的成果不仅为 forskolin 的可持续生产提供了新的方法，也为植物代谢工程领域的进一步发展奠定了基础。通过结合基因编辑技术和组织特异性表达系统，我们能够有效提升高价值天然化合物的产量，同时减少对环境的影响。这种策略的广泛应用，有望为制药行业提供更加环保和经济的生物合成方案。此外，烟草作为模型植物，其快速生长、易于转化和丰富的腺毛资源，使其成为一种理想的生物反应器，能够用于多种生物活性化合物的生产。

在实际应用中，这种植物生物反应器的构建可以大大降低生产成本，并减少对环境的破坏。相比于传统的化学合成方法，植物生物反应器能够利用光合作用产生的碳源，避免了对昂贵发酵设备的依赖。同时，植物代谢工程还能够实现对化合物合成路径的精确调控，从而提高产物的纯度和产量。因此，烟草植物在可持续生产 forskolin 方面展现出巨大潜力，为未来生物制药的发展提供了新的方向。