基于宏基因组学和宏基因组组装基因组解锁甜玉米叶际和根际生物合成潜能

《Journal of Agriculture and Food Research》：Unlocking biosynthetic potential of sweet corn ( Zea mays L. var. saccharata) phyllosphere and rhizosphere through metagenomics and metagenome-assembled genomes

本研究针对甜玉米重要病害北方玉米叶枯病（NCLB）的可持续防控需求，通过宏基因组测序和宏基因组组装基因组（MAGs）技术，首次系统揭示了Hi-Brix 3和Insee 2两个栽培品种叶际与根际微生物组的群落结构、生物合成基因簇（BGCs）多样性及其预测产物。研究发现不同生态位点微生物群落和BGC分布存在显著差异，并成功分离出具有显著抗真菌活性的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）和博戈阿萨菌（Asaia bogorensis）菌株。代谢组分析证实其产生2,4-二叔丁基苯酚和呋喃酮衍生物等潜在生物活性化合物。该研究为开发新型生物防治剂、支持甜玉米可持续病害管理提供了宝贵的微生物资源和理论依据。

　　

在泰国，甜玉米（Zea mays L. var. saccharata）是重要的经济作物，为国家出口创汇做出显著贡献。然而，在其生长过程中，多种病害严重威胁着甜玉米的健康和产量，其中由真菌Exserohilum turcicum（有性阶段为Setosphaeria turcica）引起的北方玉米叶枯病（Northern Corn Leaf Blight, NCLB）尤为突出，可导致15%至50%的产量损失，给农户带来巨大经济损失。目前，针对此类病害的防治仍高度依赖化学农药，这不仅可能引发环境污染和病原菌抗药性，也与全球倡导的农业可持续发展理念相悖。

植物并非孤立生长，它们与栖息在其表面（叶际，phyllosphere）和根部周围土壤（根际，rhizosphere）的庞大微生物群落形成了复杂的共生关系。这些微生物如同植物的“第二基因组”，在促进植物生长、增强抗逆性和抵御病原菌侵袭等方面扮演着关键角色。其中，许多微生物能够产生丰富的次级代谢产物，例如由非核糖体肽合成酶（NRPS）、聚酮合酶（PKS）等编码的抗菌化合物，这些物质是开发新型生物农药和药物的宝贵资源。尽管对玉米微生物组的研究已有开展，但多数集中在群落结构和基础功能解析上，对于其蕴藏的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters, BGCs）——即这些“天然药物工厂”的蓝图——的潜力和多样性，尤其是在甜玉米这一重要作物中，仍知之甚少。

为了填补这一知识空白，由Nattakorn Kuncharoen、Wuttichai Mhuantong等研究人员组成的团队，在《Journal of Agriculture and Food Research》上发表了一项开创性研究。他们以泰国那空叻差是玛府种植的两个主要甜玉米栽培品种——感病品种Hi-Brix 3和抗病品种Insee 2为研究对象，首次采用鸟枪法宏基因组测序技术，结合宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs）分析，深度描绘了其叶际和根际微生物世界的图谱，系统挖掘了其中隐藏的生物合成潜能，并成功分离出具有高效抗病能力的益生菌株。

为了深入探索甜玉米的微生物世界，研究人员运用了一系列关键技术。他们从田间采集了甜玉米的叶片和根际土壤样本，经过严格的DNA提取和质量控制后，进行了高通量的鸟枪法宏基因组测序。随后，利用生物信息学工具对海量序列数据进行质量控制、去除宿主（玉米）基因组污染、物种分类鉴定以及微生物群落多样性分析。更重要的是，他们通过宏基因组组装和分箱（Binning）技术，从复杂的微生物群落数据中重构出高质量的马基因组（MAGs），从而能够更精确地研究特定细菌基因组的特征。利用GECCO、TaxiBGC和antiSMASH等专业软件，研究人员系统地预测和注释了样本中以及MAGs所携带的生物合成基因簇（BGCs）及其可能产生的次级代谢产物。同时，研究团队还通过传统微生物培养方法从样本中分离细菌，并采用平板对峙法筛选了对北方玉米叶枯病病原菌Exserohilum turcicum SWI-1具有抑制活性的菌株，进而通过16S rRNA基因测序进行菌种鉴定。最后，利用气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）对活性菌株的代谢产物进行了初步分析。

3.1. 宏基因组数据集概况

研究对8个宏基因组文库进行了测序，共产生约8.25亿条原始序列读数。经过严格的质量控制和去除宿主DNA序列后，获得约2.69亿条高质量序列用于下游分析，确保了数据的可靠性。

3.2. 两个甜玉米品种叶际和根际的微生物分类谱和多样性

分析结果显示，甜玉米叶际和根际的微生物群落结构存在显著差异。在门水平上，叶际以假单胞菌门（Pseudomonadota）、厚壁菌门（Bacillota）、子囊菌门（Ascomycota）、广古菌门（Euryarchaeota）和正核糖核酸病毒界（Orthornavirae）为主；而根际则以放线菌门（Actinomycetota）、子囊菌门（Ascomycota）、硝化球形菌门（Nitrososphaerota）和班福病毒界（Bamfordvirae）为优势类群。主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA检验证实，不同组织部位（叶际 vs. 根际）是导致微生物群落差异的主要因素。香农多样性指数表明，根际的微生物多样性显著高于叶际。

3.3. 细菌MAGs的物种鉴定

研究成功重构了19个高质量（HQ）的细菌MAGs，其完整度均高于80%，污染率低于5%。物种鉴定发现，在叶际中，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas yabuuchiae）的MAGs最为常见。此外，还发现了可能代表微杆菌属（Microbacterium）、乳酸菌相关属（如Apilactobacillus, Lactobacillus）以及短状杆菌属（Brevibacterium）的新物种。根际的MAGs则主要由土壤杆菌属（Agromyces）、玫瑰杆菌属（Roseateles）、地杆菌属（Terrabacter）和农杆菌属（Agrobacterium）等组成，其中多个MAGs可能代表新的物种。

3.4. 潜在生物合成基因簇的分布

对整体宏基因组数据的BGC分析表明，在叶际和根际中，最丰富的BGC类型均为非核糖体肽（NRP）、聚酮化合物（PKS）和萜烯（terpene）。通过TaxiBGC预测特定代谢产物发现，感病品种Hi-Brix 3的叶际与fimsbactin A和类胡萝卜素的合成相关；而抗病品种Insee 2的叶际则富含与表面活性素（surfactin）、丰原素（fengycin）、杆菌霉素D（bacillomycin D）等已知抗菌化合物合成相关的BGCs。根际的BGC预测产物更为丰富多样，包括epothilone、leupyrrin、ambruticin等多种具有抗菌活性的化合物，且两个品种根际的BGC组成也存在差异。

3.5. 细菌MAGs中多样的潜在BGCs

对15个含有BGCs的HQ MAGs进行深入分析，共鉴定出38个BGCs。例如，在叶际常见的Sphingomonas yabuuchiae的MAGs中，发现了与玉米黄质（zeaxanthin）和萌发抑素（germicidin）合成相关的BGCs。在Microbacterium enclense的MAG中发现了与美里达霉素（meridamycin）和ε-聚赖氨酸（ε-Poly-L-lysine）合成相关的BGC。根际的MAGs也含有有潜力的BGCs，如Agromyces sp. MAG中的阿博霉素（aborycin）BGC，以及Terrabacter sp.和Agrobacterium pusense MAG中的沙奎霉素A（saquayamycin A）和异线肽（xenematide）BGC。

3.6. 菌株分离、抗真菌活性筛选及分子鉴定

从甜玉米样本中分离得到19株细菌，其中4株（SCR1-1, SCR1-2, SCLAB1-1, SCP1-16）对病原菌E. turcicum SWI-1表现出显著抑制活性，抑制率在64%至88.7%之间。经鉴定，SCR1-1和SCR1-2为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），SCLAB1-1和SCP1-16为博戈阿萨菌（Asaia bogorensis）。这是首次报道A. bogorensis对植物病原真菌具有拮抗活性。

3.7. 基于GC-TOF-MS的潜在生物活性化合物初步分析

对上述四株活性菌株的代谢产物提取物进行GC-TOF-MS分析，发现了一些具有已知生物活性的化合物。在A. bogorensis菌株中主要检测到5-甲基-2(3H)-呋喃酮、L-泛酰内酯、苯乙醛等化合物。在B. siamensis菌株中均检测到具有抗氧化、抗菌和抗炎活性的2,4-二叔丁基苯酚（2,4-di-tert-butylphenol），此外还含有N-羟甲基乙酰胺、多种脂肪酸甲酯等成分。这些化合物可能共同贡献了其抗真菌活性。

该研究首次全面、无偏地揭示了泰国甜玉米叶际和根际微生物组的生物合成潜力。研究结果表明，甜玉米的不同生态位点（叶际 vs. 根际）而非栽培品种，是塑造其独特微生物群落结构和BGC谱的关键因素。根际显示出比叶际更高的微生物多样性和更复杂的BGC预测产物谱，表明其是一个尚未开发的抗菌资源宝库。通过宏基因组和MAGs分析，研究人员鉴定出大量编码具有潜在抗真菌、抗菌活性的次级代谢产物（如surfactin, bacillomycin D, leupyrrin, ε-Poly-L-lysine等）的BGCs，这为了解微生物与植物、微生物与病原菌之间的化学相互作用提供了新的视角。

更重要的是，研究成功分离并鉴定了两株Bacillus siamensis和两株Asaia bogorensis，它们对甜玉米重要病害病原菌E. turcicum表现出显著拮抗作用。代谢组学分析初步揭示了其产生的潜在活性化合物（如2,4-DTBP和呋喃酮衍生物），为阐明其生防机制奠定了基础。其中，关于A. bogorensis抗真菌活性的发现属首次报道。

综上所述，这项研究不仅为甜玉米微生物组研究提供了宝贵的数据资源，深化了我们对植物-微生物互作中代谢物驱动机制的理解，而且为开发针对北方玉米叶枯病等病害的新型、高效、环境友好的生物防治制剂提供了极具前景的候选菌株，对推动泰国乃至全球甜玉米产业的可持续发展具有重要的理论和实践意义。