EGCG修饰苜蓿铁蛋白纳米颗粒增强柚皮素抗氧化特性与生物利用度的研究

《Journal of Agriculture and Food Research》：Enhanced Antioxidant Properties and Bioavailability of Naringenin through EGCG-Modified Alfalfa Ferritin Nanoparticles

本研究针对柚皮素(NAR)生物利用度低的问题，通过表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)共价修饰苜蓿铁蛋白(AFn)构建新型纳米载体(EGCG-AFn)，并封装NAR形成EGCG-AFn-NAR复合物。结果表明，该复合物显著提升抗氧化活性(DPPH/ABTS自由基清除率)，胃肠道模拟实验证实其对NAR具有保护作用，Caco-2细胞模型显示其促进细胞吸收，为功能性食品开发提供新策略。

　　

在功能性食品和营养保健品领域，如何提高天然活性成分的生物利用度一直是个重大挑战。柚皮素（Naringenin, NAR）作为一种天然黄烷酮，广泛存在于柑橘类水果中，具有显著的抗氧化、抗炎、心脏保护、抗衰老和抗糖尿病等多种生物活性。它甚至能够穿过血脑屏障，发挥多种积极的神经功能。然而，NAR的水溶性差、在胃肠道中不稳定以及肝脏快速代谢等特点，严重限制了其口服生物利用度，从而影响了其潜在健康效益的充分发挥。

另一方面，植物铁蛋白（Phytoferritin）作为一种重要的铁储存和解毒蛋白，由24个亚基自组装成一个中空的笼状结构。这种独特的结构使其成为一种理想的纳米载体，可用于包封生物活性分子，以提高其溶解度和稳定性。利用pH或温度诱导的铁蛋白可逆组装特性，研究人员已经成功将姜黄素、木犀草素、槲皮素和叶黄素等食品生物活性分子封装到铁蛋白空腔中，以改善其生物利用度。与大多数蛋白质不同，铁蛋白具有高度稳定的结构，能够在广泛的pH范围内保持其笼状构象，并能承受75°C热处理10分钟。此外，在极端酸性（pH ≤ 2）或碱性（pH ≥ 11）条件下，铁蛋白会解聚成亚基，在恢复生理pH值时又能可逆地重新组装成笼状结构。

然而，铁蛋白载体系统本身也存在一些局限性。铁蛋白在储存环境中的不稳定性，以及其在我们的胃肠道中容易被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，导致包封的生物活性分子在到达肠道之前就快速释放，这是进一步研究不可避免的问题。因此，通过修饰铁蛋白表面来设计和制造铁蛋白变体，是提高铁蛋白性能的一种可行途径。

表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate, EGCG）是绿茶中最丰富的儿茶素，具有抗肥胖、抗菌、抗癌和抗炎等多种生物活性。研究表明，EGCG可以与分离大豆蛋白和乳清蛋白形成共价键。这些相互作用可以改变蛋白质分子的净电荷，可能影响其溶解度和随后的胃肠道酶消化。当EGCG与乳清蛋白相互作用时，其抗氧化能力得以保持。酚类化合物与蛋白质之间的非共价键和共价键都可以改变蛋白质的功能、营养和结构特性。其中，酚类化合物与蛋白质的共价相互作用表现出优于非共价相互作用的稳定性。

为此，发表在《Journal of Agriculture and Food Research》上的这项研究，提出了一种创新性的解决方案：利用EGCG共价修饰苜蓿铁蛋白（Alfalfa Ferritin, AFn）表面，形成EGCG修饰的铁蛋白复合物（EGCG-AFn），旨在同时增强铁蛋白载体的稳定性和抗氧化性能，进而将NAR封装到EGCG-AFn的空腔内，最终构建出EGCG-AFn-NAR纳米颗粒，以显著提高NAR的生物利用度。

为开展本研究，作者主要应用了几个关键技术方法：通过碱法共价耦联技术将EGCG修饰到AFn表面；利用温度孵育法将NAR封装进EGCG-AFn的空腔；采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和高效液相色谱（HPLC）分别验证EGCG的成功耦联和NAR的负载；通过动态光散射（DLS）、尺寸排阻色谱（SEC）、圆二色谱（CD）和透射电子显微镜（TEM）表征纳米颗粒的理化性质；运用DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性；建立模拟胃肠道消化模型和Caco-2细胞单层模型分别考察NAR的释放行为和细胞摄取能力。

3.1. EGCG-AFn的合成

研究人员成功表达并纯化了苜蓿铁蛋白（AFn）。通过碱法在AFn与EGCG摩尔比为1:400的条件下实现了EGCG与AFn的共价耦联，此时蛋白回收率最高（90.3%），每个AFn约耦联87个EGCG分子。表征结果显示，EGCG-AFn保持了与AFn相似的球形笼状结构和尺寸，二级结构也未发生显著变化，表明EGCG的成功修饰并未破坏铁蛋白的天然形态。然而，EGCG-AFn的熔解温度（Tm = 73°C）略低于AFn（Tm = 77°C），说明EGCG修饰对铁蛋白的热稳定性有一定影响。紫外-可见吸收光谱在270 nm处的特征峰以及荧光光谱的淬灭和红移，均证实了EGCG成功耦联到AFn表面，并改变了色氨酸残基的微环境。

3.2. FTIR分析

FTIR光谱分析为EGCG与AFn之间的相互作用提供了进一步证据。EGCG-AFn复合物在3340 cm^-1（酰胺A带）、1657 cm^-1（酰胺I带）和1521 cm^-1（酰胺II带）显示出特征峰。酰胺A带相对于EGCG和AFn单独峰的红移，表明EGCG的羟基与AFn的氨基之间形成了氢键。酰胺II带在1521 cm^-1处增强且略微移动（相对于AFn的1513 cm^-1），提示形成了新的C-N键，这证明了EGCG与AFn之间存在共价相互作用。

3.3. EGCG-AFn/NAR的合成

通过温度孵育法将NAR负载到EGCG-AFn的空腔内。当NAR与EGCG-AFn的摩尔比为300:1时，负载效率最高，估计每个EGCG-AFn笼中可封装约60个NAR分子。负载NAR后，纳米颗粒的粒径、分散性（PDI）和zeta电位仅有轻微变化，TEM和SEC证实其仍保持球形笼状结构，CD光谱表明其二级结构（α螺旋）未受影响。HPLC分析确定NAR的负载量（LC）为3.1%，封装效率（EE）为20.5%。

3.4. AFn NPs的理化稳定性

储存稳定性实验表明，在4°C和25°C下储存21天，EGCG-AFn和EGCG-AFn-NAR的蛋白保留率均显著高于未修饰的AFn。特别是在25°C下，AFn的蛋白保留率仅为17.2%，而EGCG-AFn和EGCG-AFn-NAR则分别达到59.5%和较高水平。同时，在4°C下储存21天，EGCG-AFn-NAR中NAR的泄漏量仅为18%，而在25°C下为40%，证明EGCG修饰显著提高了纳米载体及其负载物的储存稳定性。

3.5. 抗氧化活性分析

抗氧化实验结果表明，EGCG-AFn共价复合物对DPPH和ABTS自由基的清除率均显著高于未修饰的AFn。共价键合使EGCG能紧密附着在AFn分子上，增加了局部浓度以及与自由基碰撞的概率，从而增强了自由基的捕获和清除效率。负载NAR后形成的EGCG-AFn-NAR也表现出良好的抗氧化活性。

3.6. 模拟胃肠道消化中NAR的释放

在模拟胃液和肠液中，游离NAR的释放速率最快。AFn-NAR和EGCG-AFn-NAR中NAR的释放速率均慢于游离NAR，且EGCG-AFn-NAR的释放速率最慢。在模拟肠液中2小时后，EGCG-AFn-NAR的NAR释放率（32.31%）显著低于AFn-NAR（40.48%）和游离NAR（52.45%）。这表明EGCG与铁蛋白的耦联可能屏蔽了消化酶的结合位点，增强了铁蛋白在胃肠道流体中的稳定性，从而更好地保护了包封的NAR。

3.7. NAR的细胞摄取

利用Caco-2细胞单层模型评估NAR的吸收。结果表明，EGCG-AFn-NAR纳米颗粒通过Caco-2单层的NAR总量（3.18 μg）高于AFn-NAR（2.84 μg）和游离NAR（1.78 μg）。这表明AFn和EGCG-AFn纳米颗粒比游离NAR更有利于细胞吸收。其原因在于铁蛋白通过AP2依赖的内吞作用被Caco-2细胞摄取，这种独特的吸收途径克服了酚类植物化学物质因缺乏特定受体而导致的细胞渗透性差的问题。

综上所述，本研究成功构建了EGCG共价修饰的苜蓿铁蛋白纳米载体（EGCG-AFn），并实现了黄烷酮化合物柚皮素（NAR）的高效封装，形成EGCG-AFn-NAR纳米颗粒。该研究得出结论：EGCG修饰不仅增强了铁蛋白纳米载体本身的稳定性，还显著提升了其抗氧化性能；所构建的EGCG-AFn-NAR纳米颗粒能有效延缓NAR在模拟胃肠道环境中的释放，并对NAR起到良好的保护作用；更重要的是，基于铁蛋白特有的细胞摄取途径，EGCG-AFn-NAR纳米颗粒能有效促进Caco-2细胞对NAR的吸收，从而有望大幅提高NAR的口服生物利用度。

这项研究的意义在于，它开发了一种优化的口服递送系统，巧妙地将铁蛋白的纳米封装能力与EGCG的抗氧化和潜在稳定作用相结合，为改善膳食黄酮类化合物及其他生物活性成分的递送效率提供了新思路。EGCG-AFn纳米颗粒在功能性食品和营养保健品领域作为口服递送载体具有广阔的应用前景。未来的工作将侧重于其体内药代动力学、组织分布和长期安全性的研究，并将其应用扩展到其他不稳定或难溶性天然化合物的封装中。