冠状病毒-1程序性核糖体移码效率的RNA结构整体决定因素：跨冠状病毒进化的新见解

《Journal of Molecular Biology》：RNA Structural Ensemble Determinants of -1 Programmed Ribosomal Frameshifting Efficiency Across Coronavirus Evolution

本刊推荐：为阐明冠状病毒-1程序性核糖体移码效率的结构基础，研究人员对四种新型-1 PRF元件进行了结构和功能分析。研究发现，此前在SARS-CoV-2中确立的结构/功能关系并非普适，高效的-1 PRF不一定依赖于复杂的结构整体，且上游序列元件对移码效率具有显著调控作用。该研究为理解病毒进化中关键基因表达调控机制的精细调控提供了新视角，并展示了其在生物技术中的应用潜力。

　　

在病毒与宿主持续博弈的微观世界中，病毒巧妙地利用其有限的基因组编码尽可能多的蛋白质，以完成复杂的生命周期。程序性核糖体移码是其中一种关键的转录后调控机制，它允许核糖体在翻译过程中发生读码框的偏移，从而从同一段mRNA序列产生不同功能的蛋白质。在冠状病毒中，尤其是近年来深刻影响全球的SARS-CoV-2，-1程序性核糖体移码是病毒复制所必需的关键步骤，其效率的细微变化可能直接影响病毒的毒力和适应性。

然而，科学界对于究竟是什么精细调控着-1 PRF的效率，尤其是在不同冠状病毒物种间其决定因素是否保守，仍存在许多疑问。先前对SARS-CoV-2的研究表明，其刺激移码的RNA元件并非采用单一的静态结构，而是存在一个复杂的、可能相互转换的结构整体，并且结构的复杂性似乎与高效的移码功能相关。但这是否是冠状病毒家族的普遍规律？其他冠状病毒是否采用相同的策略？驱动移码效率的核心结构特征究竟是什么？为了回答这些问题，由Scott R. Allen、Tamar Schlick和Alain Laederach组成的研究团队开展了一项跨冠状病毒物种的比较研究，其成果发表在《Journal of Molecular Biology》上。

研究人员为阐明冠状病毒-1 PRF效率的结构决定因素，综合运用了几项关键技术。他们首先通过双荧光素酶报告基因检测系统，精准定量了五种冠状病毒（包括SARS-CoV-2、穿山甲冠状病毒等）的-1 PRF效率。接着，利用二甲硫酸盐突变分析图谱技术对每种病毒的RNA结构进行探测。为了解析复杂的结构整体，他们采用了DANCE-MaP这一先进方法对DMS-MaP数据进行分析，以鉴定不同的构象状态。此外，还使用PAIR-MaP技术来高置信度地识别RNA分子内的直接碱基配对相互作用。对于序列差异较大的病毒元件，则辅以ShapeKnots进行DMS信息约束的热力学建模。最后，通过构建上游序列互换的突变体，并结合功能 assay 和结构分析，深入探究了上游序列对移码的调控作用。

实验结果

实验确认-1 PRF活性

研究选取了五种冠状病毒序列进行研究，包括SARS-CoV-2以及四种预测具有移码刺激元件功能的新序列。通过双荧光素酶 assays 确认，所有五种野生型序列均能引发移码，但其效率存在显著差异，范围在19%至30%之间。其中，夜鹭冠状病毒效率最低，而穿山甲冠状病毒和BtRs-Beta冠状病毒效率最高。这为后续比较不同效率元件的结构差异奠定了基础。

穿山甲冠状病毒FSE的比较结构分析

通过对SARS-CoV-2和穿山甲冠状病毒的DMS-MaP数据进行DANCE-MaP去卷积分析，发现两者在87核苷酸的FSE区域均存在三个构象状态，且这些状态之间具有高度相关性。通过接收者操作特征曲线分析，将这些状态与已知的SARS-CoV-2 FSE构象模型进行匹配，结果表明穿山甲冠状病毒与SARS-CoV-2在该区域的结构整体是保守的。研究还证实，本研究中使用的报告基因序列其结构特征与病毒感染细胞模型中的结构高度相关，表明研究模型具有生物学相关性。

BtRs-BetaCoV、Rousettus-Bat-CoV和Night-Heron-CoV病毒序列的整体分析

对另外三种冠状病毒的结构整体分析揭示了出乎意料的结果。与SARS-CoV-2和穿山甲冠状病毒的复杂整体不同，BtRs-BetaCoV仅呈现单一构象状态，但其移码效率却位列前茅。这挑战了“构象状态越多，移码效率越高”的先前认知。Rousettus-Bat-CoV和Night-Heron-CoV则分别呈现两种构象，但后者在FSE区域仅有一种构象。通过结构建模和共变异分析发现，这些冠状病毒的FSE趋向于采用一组有限的亚结构，所有构象都包含某种形式的茎I（或竞争性结构）和茎III（或其变体），且茎II的3‘端锚定核苷酸高度保守。

相关的化学探测分析为-1 PRF效率的结构决定因素提供不依赖建模的见解

利用PAIR-MaP技术直接分析碱基配对相互作用，研究人员发现，移码效率较好的元件（如SARS-CoV-2、穿山甲冠状病毒）其PAIRs数据支持替代茎I的存在以及与FSE的上游相互作用，而效率较差的元件（如Rousettus-Bat-CoV、Night-Heron-CoV）则缺乏此类相互作用的证据。此外，较好的移码元件倾向于缺乏支持典型茎I形成的PAIRs，反而支持其竞争结构茎I*或AS1。令人惊讶的是，对于衰减发夹这一已知的负调控元件，其存在与否或强弱与移码效率的关系在不同冠状病毒中并不明确，例如高效移码的BtRs-BetaCoV反而存在支持更强AH的PAIRs。

近端序列元件包含-1 PRF效率的新型调控因子

通过构建SARS-CoV-2和Night-Heron-CoV之间AH上游序列的互换突变体，功能实验显示，上游序列对移码效率具有强大的调控作用。将高效移码者（SARS-CoV-2）的上游序列置换给低效移码者（Night-Heron-CoV）可显著提升其效率，反之亦然。这种效应大部分独立于AS1的形成。对突变体的PAIRs和DMS反应性分析表明，上游序列的置换改变了FSE区域的构象整体平衡，例如在改善的突变体中出现了不利于茎I形成的新构象，而在恶化的突变体中则观察到AH的延伸/增强以及向茎I形成的倾斜。这揭示了在AH区域紧邻的上游序列中存在独立且强效的-1 PRF调控元件。

讨论与结论

本研究通过一系列不依赖于热力学建模的分析方法，揭示了冠状病毒-1 PRF效率调控的复杂性和多样性。研究结果表明，没有一个单一的结构或序列特征能够独立预测-1 PRF效率，而是多种因素协同作用的结果。关键的发现包括：首先，结构整体的复杂性并非高效-1 PRF的普遍必需条件，如BtRs-BetaCoV所示。其次，较好的移码元件普遍表现出避免形成典型茎I，而倾向于形成其竞争结构茎I*或与上游序列相互作用形成AS1的趋势，这暗示了核糖体翻译过程中动态结构重排的重要性。第三，上游序列元件，特别是AH紧邻的上游区域，包含着独立于AS1的、强效的移码调控因子，其通过直接碱基配对相互作用显著影响移码效率。

这些发现不仅深化了我们对冠状病毒关键基因表达调控机制的理解，揭示了病毒在进化过程中如何精细调控其生命活动，而且挑战了此前基于单一病毒模型（如SARS-CoV-2）得出的某些结论的普适性。该研究提供的分析框架和鉴定的短小移码元件，为在生物技术中精确调控蛋白质化学计量比或紧凑包装基因治疗载荷提供了新的工具和思路。总之，这项工作凸显了在理解重要生物学过程时，进行跨物种比较研究和采用多种互补分析技术的重要性，为未来针对病毒关键调控元件的干预策略提供了新的视角和靶点。