基于柑橘百里香精油优化纳米乳液的增强型抗菌抗生物膜特性研究

《LWT》：Nanoformulation of an optimized Citrus sinensis and Thymus broussonetii essential oil combination for enhanced antimicrobial and antibiofilm properties.

本研究针对柑橘精油(EO)抗菌活性有限的问题，开发了甜橙(Citrus sinensis)与布罗森百里香(Thymus broussonetii)精油的优化纳米乳液。通过十点单纯形-中心混合物设计获得最佳配比(23%甜橙EO+77%布罗森百里香EO)，其纳米乳液粒径63.69nm，PDI 0.098，对五种致病菌表现出显著抗菌活性，亚MIC浓度下生物膜抑制率达74.96%，预形成生物膜清除率最高达77.56%，为柑橘副产物高值化利用和天然抗菌剂开发提供了新策略。

　　

在全球抗菌素耐药性日益严峻的背景下，寻找天然有效的抗菌替代品成为当务之急。摩洛哥作为世界主要橙子生产国，其柑橘加工业每年产生大量橙皮废弃物，这些副产物占果实总质量的50%，不仅造成资源浪费，还带来环境负担。虽然从柑橘皮中提取的富含柠檬烯的精油具有一定的抗菌潜力，但其单独使用时的抗菌效果有限，最小抑菌浓度(MIC)值往往较高，限制了其实际应用价值。

与此同时，摩洛哥特有的两种百里香物种——摩洛哥百里香(Thymus maroccanus)和布罗森百里香(Thymus broussonetii)，因其富含香芹酚和百里香酚等强效抗菌成分而备受关注。这些酚类单萜化合物通过破坏微生物膜结构和干扰细胞功能发挥杀菌作用，但如何将柑橘精油的资源优势与百里香精油的强效抗菌特性有机结合，仍是一个值得深入探索的科学问题。

在这项发表于《LWT》的研究中，来自摩洛哥卡迪阿亚德大学的研究团队开展了一项创新性研究，他们通过先进的混合物设计方法和纳米乳化技术，成功开发出一种具有增强抗菌和抗生物膜特性的精油纳米乳液。该研究不仅为柑橘加工副产物的高值化利用提供了可持续方案，也为开发新型天然抗菌剂奠定了理论基础。

研究人员采用了几项关键技术方法开展研究。首先通过水蒸气蒸馏法从甜橙皮和两种百里香的地上部分提取精油，并利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析其化学成分。采用增强型十点单纯形-中心混合物设计优化三种精油的最佳配比，以最小抑菌浓度为响应值建立数学模型。通过超声乳化法制备精油纳米乳液，并利用动态光散射技术表征其粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位。采用微量肉汤稀释法测定抗菌活性，通过结晶紫染色法评估生物膜抑制和清除效果，并借助扫描电子显微镜(SEM)观察生物膜形态变化。

3.1. GC-MS分析

研究结果显示，甜橙精油主要成分为柠檬烯(90.98%)，属于单萜烃类化学型(94.64%)。摩洛哥百里香精油富含香芹酚(70.52%)，而布罗森百里香精油则同时含有较高含量的香芹酚(48.14%)和百里香酚(21.37%)，两者均以含氧单萜为主(74.74%-78.29%)。优化后的精油混合物(23%甜橙EO+77%布罗森百里香EO)化学组成丰富，主要成分包括香芹酚(38.40%)、百里香酚(16.37%)、柠檬烯(19.65%)和对伞花烃(4.69%)。

3.2. 单一和复合精油的抗菌活性

抗菌实验表明，甜橙精油单独使用时抗菌效果最弱(MIC>2.5μL/mL)，而两种百里香精油表现出较强的抗菌活性(MIC为0.19-1.56μL/mL)。重要的是，甜橙精油与百里香精油的二元混合物显示出显著的协同效应，对抗所有测试细菌均能降低MIC值。统计分析证实，甜橙与布罗森百里香、甜橙与摩洛哥百里香的二元组合对金黄色葡萄球菌、肠沙门氏菌和铜绿假单胞菌均产生显著协同作用(p<0.05)。

3.3. 混合物优化和纳米配方

通过期望函数优化，研究人员确定了最佳精油配比为23%甜橙EO和77%布罗森百里香EO，期望值达98%。该优化混合物经纳米乳化后，形成粒径为62.8nm、PDI为0.098的稳定纳米乳液。稳定性测试显示，储存一个月后粒径仅增至91.24nm，PDI保持稳定(0.10)，表明配方具有良好的短期稳定性。实验测得的MIC值与模型预测值高度一致，验证了模型的可靠性。

3.4. 生物膜形成和抑制

纳米乳化精油混合物对所有测试菌株的生物膜形成均表现出显著抑制效果。在最敏感的菌株大肠杆菌中，即使在低至MIC/64的亚抑制浓度下，抑制率仍达66.48%-74.96%。金黄色葡萄球菌的抑制率为51.33%-74.52%，而铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌和肠沙门氏菌的反应较为多变。扫描电镜观察直观显示了处理组生物膜结构的显著破坏，细菌密度降低，细胞分散，缺乏可见的胞外基质。

3.5. 已形成生物膜的清除

纳米配方对预形成的生物膜也表现出明显的清除能力。在4MIC浓度下，对大肠杆菌和肠沙门氏菌的生物膜清除率最高，分别达77.56%和77.09%。对金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的清除效果中等(61.87%和45.80%)，而对铜绿假单胞菌的清除效率最低(28.33%)，这与该菌已知的复杂生物膜结构和强大防御机制相符。

该研究通过系统的实验设计和深入的结果分析，得出了一系列重要结论。研究表明，基于混合物设计方法优化配比的甜橙和布罗森百里香精油纳米乳液，能够显著提升抗菌和抗生物膜活性。这种协同效应主要归因于配方中关键单萜类化合物(柠檬烯、百里香酚和香芹酚)的互补作用，以及纳米乳化技术带来的理化性质改善。纳米级液滴尺寸增大了界面面积，提高了疏水性精油成分的溶解性、分散性和细胞摄取率，使其能够更有效地穿透生物膜基质，作用于深层细菌。

从应用角度看，这项研究不仅为柑橘加工副产物的高值化利用提供了创新途径，符合循环经济原则，也为开发对抗抗菌素耐药性的天然替代方案提供了科学依据。优化配方在亚抑制浓度下表现出的显著生物膜抑制效果，特别适用于预防性应用场景，而其对已形成生物膜的清除能力则展示了其治疗潜力。

然而，研究也指出了未来需要进一步探索的方向。包括阐明关键成分在细胞和膜水平的协同作用机制，进行全面的毒理学评估以确保应用安全性，以及在各种环境条件下进行长期稳定性研究。特别值得注意的是，为确保协同评估的可靠性，未来工作应完全依赖纳米乳化配方而非DMSO溶解的精油。此外，精油成分的强烈芳香特性可能影响处理产品的感官接受度，这也是实际应用中需要考虑的因素。

总体而言，这项研究展示了如何通过智能配方设计和先进纳米技术，将农业副产物转化为高附加值生物活性剂的成功范例，为可持续发展和天然抗菌剂开发提供了重要参考。