基于一氧化氮介导的热休克蛋白抑制策略：混合膜包被多功能纳米平台逆转宫颈癌化疗耐药性研究

《Materials Today Bio》：Overcoming chemoresistance via NO-mediated HSP inhibition using hybrid membrane-coated multifunctional nanoplatforms

本研究针对宫颈癌化疗耐药及药物靶向递送难题，开发了一种集光热/光动力/化疗/气体治疗于一体的混合仿生纳米平台CuS-PTX-ICG-L-arg@HR。该平台通过红细胞膜与HeLa细胞膜融合实现免疫逃逸与肿瘤靶向双重功能，并创新性地利用近红外光控释放一氧化氮抑制HSP70表达，显著增强紫杉醇对耐药肿瘤的杀伤效果。研究表明该纳米系统在体内外均展现出优异抗肿瘤效果，为克服化疗耐药提供了新策略。

　　

在全球范围内，宫颈癌（Cervical Cancer）是女性癌症相关发病率的第四大原因，对于无法手术的患者而言，化疗仍然是标准治疗方案。然而，化疗耐药性（Chemoresistance）的普遍存在严重限制了其疗效。热休克蛋白（Heat Shock Proteins, HSPs）被证实是导致肺癌、卵巢癌、肝癌和乳腺癌等多种癌症化疗耐药的关键因素。尽管HSPs在维持正常细胞稳态中发挥重要作用，但它们在肿瘤细胞中的异常过表达通过稳定错误折叠蛋白和抑制凋亡促进癌症进展。值得注意的是，HSP70和HSP90在光热治疗（Photothermal Therapy, PTT）过程中的高温应激下会上调，而抑制这些蛋白已被证明可以增强PTT疗效。然而，尽管这些观察结果很有前景，但目前尚未建立针对HSPs逆转化疗耐药性的临床可行策略。

在这一背景下，气体治疗（Gas Therapy）特别是利用一氧化氮（Nitric Oxide, NO）的策略，已成为对抗HSP介导的治疗耐药性的有前景方法。作为一种多功能信号分子，NO调节多种细胞内通路，有效抑制HSP表达。然而，NO基治疗的临床转化面临重大挑战，主要由于气态分子在体内的稳定性差和可控性有限。为了解决这些限制，将NO与先进的纳米递送系统（Nano-delivery Systems）整合已成为关键研究方向，从而实现精确的时空释放和靶向递送至肿瘤部位。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，研究人员开发了一种新型混合仿生纳米平台，通过将空心硫化铜纳米颗粒（CuS NPs）与混合细胞膜包被相结合，实现了增强的肿瘤靶向性和延长的血液循环时间。这一创新系统同时递送吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）作为光敏剂、L-精氨酸（L-arginine, L-arg）作为NO前体以及紫杉醇（Paclitaxel, PTX）作为化疗药物，创建了PTT和化疗增敏的协同组合。

研究人员采用了几项关键技术方法开展研究：通过融合红细胞膜与HeLa细胞膜构建具有免疫逃逸和肿瘤靶向双重功能的混合膜包被；利用空心CuS纳米颗粒作为药物载体同时负载PTX、ICG和L-arg；建立HeLa细胞移植瘤小鼠模型评估体内靶向性和治疗效果；采用Western blot和免疫组化分析HSP70表达水平；通过Griess法和DAF-FM DA荧光探针检测NO生成；使用DPBF法和DCFH-DA探针评估活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）产生。

3.1. CuS-PIA@HR NPs的制备与表征

研究人员通过三步合成法制备了CuS-PIA@HR NPs：首先合成空心CuS纳米颗粒作为核心结构，随后将PTX、ICG和L-arg共同负载到CuS基质中，得到中间产物CuS-PIA NPs，最后通过混合膜包被获得完整纳米平台。透射电镜显示纳米颗粒具有明显的膜层结构，粒径约70纳米。药物负载效率分析表明PTX、ICG和L-arg的封装效率分别为86.3%、65%和61.4%。蛋白质凝胶电泳证实了HeLa细胞膜和红细胞膜蛋白的成功转移，这对于实现膜壳的仿生功能至关重要。

3.2. 体外光热性能和PTX释放分析

光热性能评估显示，CuS-PIA@HR NPs在808纳米激光照射下表现出浓度和功率依赖的温度升高，光热转换效率达到42.5%，显著高于单纯CuS NPs（23.5%）和游离ICG（12.6%）。药物释放研究表明，在酸性环境（pH=5.6）结合近红外激光照射条件下，PTX的累积释放率达到88.3%，显示出酸性肿瘤微环境与外部光热刺激之间的协同效应。

3.3. ROS和NO的体外生成能力

通过DPBF探针法证实CuS-PIA@HR NPs在激光照射下具有强大的ROS生成能力。Griess法检测显示NO释放具有纳米颗粒浓度和激光功率密度的双重依赖性，且可通过激光开关实现可控释放。细胞实验进一步验证了激光激活的ICG在纳米颗粒内生成ROS，进而促进NO的产生。

3.4. 体外细胞摄取、细胞毒性和PTT/PDT测定

CCK-8实验证明CuS-PIA@HR NPs在肿瘤细胞和正常细胞中均呈现浓度依赖性细胞毒性，但在安全浓度（200 μg/mL）下表现出良好生物相容性。共聚焦显微镜观察显示，混合膜包被的纳米颗粒在HeLa细胞中的摄取效率显著高于正常细胞和巨噬细胞，证实了其靶向性和免疫逃逸能力。活/死细胞染色和流式细胞术分析表明，CuS-PIA@HR NPs联合激光照射可诱导99.6%的肿瘤细胞死亡，显著优于未加载L-arg的对照组。

3.5. 体内代谢和靶向分析

体内分布实验显示，纳米颗粒在肿瘤部位的荧光强度在注射后8小时达到峰值，表明此为最佳治疗干预时间窗口。主要通过肝肾系统进行代谢清除，48小时后在主要器官中的残留量较低，显示出良好的生物可降解性。

3.6. 体内生物安全性

溶血实验表明纳米颗粒在浓度高达300 μg/mL时溶血率仍低于3%，符合生物安全性要求。血液生化分析和组织切片观察显示，纳米颗粒处理组与对照组在肝肾功能指标和主要器官组织结构上无显著差异，证实了其良好的体内生物相容性。

3.7. CuS-PIA@HR NPs对HSP70表达的抑制

Western blot分析显示，PTX化疗单独处理以及ICG联合激光处理均显著上调肿瘤组织中HSP70蛋白表达，而在CuS-PIA@HR NPs处理组中，HSP70表达基本保持不变。免疫组化结果进一步在组织水平验证了NO对PTT和PTX联合治疗诱导的HSP过表达的显著抑制作用，抑制率达到70%。

3.8. 体内抗肿瘤疗效

动物实验表明，CuS-PIA@HR NPs联合激光照射可显著抑制肿瘤生长，肿瘤体积减少73.3%。TUNEL染色显示治疗组肿瘤细胞死亡面积显著扩大，而主要器官未见明显病理改变。体重监测结果证实纳米颗粒处理不会引起明显的全身毒性反应。

本研究成功开发了一种多功能纳米递送平台，通过混合膜包被技术实现了药物的靶向递送和免疫逃逸，同时创新性地利用光控NO释放抑制HSP70表达，有效逆转了宫颈癌的化疗耐药性。该策略不仅提高了化疗药物的治疗效果，还通过多模式协同作用实现了对肿瘤的精准打击。重要的是，这一平台展现出优异的生物相容性和安全性，为临床转化奠定了坚实基础。该研究为克服肿瘤化疗耐药提供了新思路，展示了纳米技术在精准癌症治疗中的巨大潜力。