基于MESIF材料的Winogradsky柱时空分析揭示草甘膦对沉积物微生物群落的影响

《Methods》：Materials-Based spatiotemporal analysis of microbial responses to glyphosate in Winogradsky columns

本研究针对草甘膦对非靶标微生物群落的影响问题，开发了一种结合大孔弹性硅胶泡沫（MESIF）的Winogradsky柱模型系统，实现了对底栖微生物群落的无创时空监测。研究发现草甘膦处理会延迟微生物分层，减少铁氧化和硫酸盐还原菌的特征色素形成，并导致群落组成显著变化，同时富集了潜在的草甘膦降解菌株。该方法为研究环境胁迫下微生物群落动态提供了创新平台。

　　

草甘膦作为全球使用最广泛的除草剂活性成分，其潜在的环境影响日益受到关注。这种通过抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）来阻断莽草酸途径的化合物，虽然对缺乏该途径的动物相对安全，但对许多微生物具有潜在毒性。随着农业中草甘膦使用量的不断增加，了解其对非靶标微生物群落的影响变得尤为重要。然而，传统研究方法存在明显局限：现代测序技术虽然能提供详细的群落组成信息，但通常只能进行终点检测，需要在分析时物理破坏微生物生态系统，无法实现真正的时空动态监测。

为了解决这一技术瓶颈，来自卡尔斯鲁厄理工学院的研究团队开发了一种创新的研究方法。他们在《Methods》杂志上发表的研究中，将Winogradsky柱这一经典的微生物生态系统模型与新型采样材料相结合，建立了能够进行时空分辨率分析的研究平台。Winogradsky柱是以俄罗斯微生物学家Sergei Winogradsky命名的自包含沉积物生态系统，能够模拟自然环境条件，为研究微生物多样性、代谢活动和生态相互作用提供理想模型。

研究人员采用的核心技术创新是大孔弹性硅胶泡沫（MESIF）材料系统。这种生物惰性多孔材料由聚二甲基硅氧烷（PDMS）通过简单的程序制备而成，具有宏观孔隙结构，能有效支持微生物定殖。研究团队将MESIF材料切割成小块并安装在特制的不锈钢框架中，然后垂直嵌入填充湖相沉积物的Winogradsky柱内。这种设计使得研究人员能够在不同时间点移出框架，分析定殖在MESIF上的微生物群落，而不会显著干扰沉积物结构。

研究设置了四种不同的实验条件：含1%（w/w）草甘膦并暴露于光照（+G+L）、含草甘膦但避光（+G-L）、不含草甘膦但暴露于光照（-G+L）以及不含草甘膦且避光（-G-L）。每种条件设置两个重复柱体，在20天、72天和109天的时间点分别取出MESIF框架进行后续分析。

关键技术方法包括：MESIF材料的制备和表征、Winogradsky柱的构建与条件控制、时空采样策略的实施、16S rRNA基因V3区扩增子测序，以及基于QIIME2平台的生物信息学分析（包括α和β多样性分析、分类学注释和差异丰度分析）。研究使用的沉积物样本来自当地淡水湖（Saalbachniederungen Hambrücken），于2022年3月1日采集。

实验工作流程设计方面，研究团队开发了模块化采样系统，将MESIF材料固定在不锈钢框架上，实现了对Winogradsky柱垂直梯度上不同位置（好氧顶部、过渡中层和厌氧底部）的系统采样。每个取出的框架包含三个相同大小的MESIF片，确保了不同深度样本的可比性。这种标准化设计减少了重复间的变异性，使得跨时间点的群落动态评估具有可重复性。

Winogradsky柱发育过程中的视觉观察显示，草甘膦处理对微生物群落产生了明显影响。到第20天时，未处理的光照柱（-G+L）出现了硫酸盐还原菌特有的暗色底层，而相应的草甘膦处理柱（+G+L）则未观察到这一现象。到第72天，两种柱体都形成了明确的分层，但-G+L柱表现出更显著的铁氧化菌橙色色素沉着，这种色素在+G+L柱中较为不明显。研究人员推测，草甘膦作为金属螯合剂，可能通过螯合铁而抑制了铁氧化物的形成，从而延迟了特征色素的出现。

基于测序的微生物组多样性评估揭示了更深入的发现。α多样性分析显示，所有条件下的微生物多样性都随时间增加，但草甘膦暴露和光照对样本内生物多样性没有显著影响。然而，β多样性分析则呈现出不同的模式：无草甘膦的柱体无论光照条件如何，群落都紧密聚集在一起，而引入草甘膦作为胁迫因子则使群落更加分散。特别值得注意的是，+G+L条件表现出最大的群落不稳定性，样本间差异最大，表明草甘膦和光照的组合效应对微生物群落产生了最显著的影响。

微生物群落分类学分析显示，草甘膦处理选择性地影响了微生物组成。在草甘膦存在下，酸杆菌门（Acidobacteriota）减少，而芽孢杆菌门（Bacillota）和拟杆菌门（Bacteroidota）增加。候选辐射菌门（Patescibacteria）主要在没有草甘膦的情况下检测到，表明该群体无法耐受草甘膦暴露。相反，绿弯菌门（Chloroflexota）随时间逐渐增加，特别是在草甘膦存在下，表明该门类微生物可能具有耐受性或间接生态益处。脱硫杆菌门（Desulfobacterota）随时间增加，支持了早期视觉观察中草甘膦最初抑制硫酸盐还原菌生长的推测。

对微生物类群响应草甘膦和光照的变化进行深入分析发现，草甘膦暴露导致了微生物丰度的显著变化，光照也影响了微生物组组成。毛螺菌科（Lachnospiraceae）中一个未分类的属仅在草甘膦存在下富集，特别是在黑暗条件下。类似趋势也在厌氧杆菌科（Anaerovoracaceae）和克里斯滕森菌科（Christensenellaceae）中的新属中观察到，它们仅在草甘膦处理条件下显著富集。几个梭菌属（Clostridium）物种在草甘膦存在下也出现富集。纵向分析显示，关键的微生物家族仅在草甘膦存在下富集，而在没有草甘膦的情况下不存在。

研究结论表明，基于MESIF的Winogradsky柱采样方法为研究草甘膦对土壤细菌的影响提供了有效的时空分辨率平台。草甘膦处理延迟了微生物分层，减少了铁氧化和硫酸盐还原菌的特征色素形成。虽然α多样性保持相对稳定，但草甘膦暴露导致了群落组成的显著变化，包括潜在草甘膦降解类群的富集。视觉观察到的分层模式为草甘膦对微生物群落的影响提供了早期证据，而测序结果进一步揭示了草甘膦存在与微生物群落组成变化之间的强相关性。

这项研究的重要意义在于建立了一种创新的微生物群落时空监测方法，克服了传统终点检测的局限性。MESIF材料系统的应用使得非破坏性、多时间点的群落动态分析成为可能，为研究环境胁迫下微生物生态系统的响应提供了新工具。研究发现不仅证实了草甘膦对微生物群落的影响，还识别出了可能参与草甘膦降解的微生物类群，为后续的功能研究和潜在的生物修复应用奠定了基础。该方法的可扩展性和适应性也使其有望应用于其他环境和污染物的微生物生态学研究，推动我们对复杂微生物生态系统的理解。