单增李斯特菌通过Lmo1799过表达进化成为强生物膜形成菌株的机制研究

《Microbiological Research》：Evolution of Listeria monocytogenes to a strong biofilm producer via the overexpression of Lmo1799

本研究针对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)在食品加工环境中持久存在的难题，通过实验进化系统成功筛选出生物膜形成能力显著增强的变异菌株。研究人员发现Lmo1799蛋白的过表达是促进生物膜形成的关键机制，该蛋白通过改变细胞表面疏水性而增强细菌附着能力。这项工作为理解食源性病原体的环境适应性提供了新视角，对食品安全生产具有重要指导意义。

　　

在食品加工环境中，单增李斯特菌这种食源性病原体能够形成生物膜，这为其在不利条件下的存活和持久存在提供了保护机制。生物膜是微生物嵌入自身产生的细胞外基质中形成的群落结构，能够帮助细菌抵抗干燥、抗菌剂和消毒剂的作用。然而，单增李斯特菌进化成为强生物膜形成菌株的潜在策略尚未得到充分研究。

为了解决这一问题，来自瓦赫宁根大学的研究团队在《Microbiological Research》上发表了他们的最新研究成果。他们通过实验进化系统，成功分离出单增李斯特菌EGDe（参考菌株）和FBR16（超突变食物分离株）的强生物膜产生菌株，并深入探讨了其分子机制。

研究人员主要运用了实验进化系统、晶体紫染色法、表面疏水性测定、蛋白质组学分析、全基因组测序和基因敲除技术等方法。他们通过珠粒实验系统模拟生物膜形成周期，使用蛋白质组学比较变异菌株与原始菌株的蛋白表达差异，并通过基因工程手段构建突变体验证关键基因功能。

3. 结果

3.1. 强生物膜形成菌株的分离

通过珠粒实验进化系统，研究人员在4-6周内成功分离出进化变异菌株。晶体紫染色结果显示，EGDe和FBR16的EV菌株生物膜形成量分别增加了3-7倍。

3.2. AN和EV分离株的生长性能和生物膜定量

尽管EV菌株的浮游生长与AN菌株相似，但其生物膜形成能力显著增强，在培养5小时后就表现出明显的差异。

3.3. 在不同表面的附着能力

EV菌株在塑料和不锈钢表面显示出更强的附着能力，特别是在气-液界面的生物膜形成明显增加，而在玻璃表面差异不显著。

3.4. 细胞表面疏水性

两种EV菌株在指数期和稳定期均表现出比AN菌株更高的表面疏水性，这解释了其增强的附着能力。

3.5. 蛋白质组学分析

蛋白质组学分析发现，Lmo1798和Lmo1799在EGDe EV菌株中分别上调40倍和13倍，在FBR16 EV菌株中上调超过200倍，表明这两个蛋白在生物膜形成中起关键作用。

3.6. 单增李斯特菌EGDe EV中突变的鉴定

基因组分析发现EGDe EV菌株在lmo1799上游区域有一个单碱基插入，以及在lmo1799基因内有一个42个碱基的框内缺失，导致Ala-Asp串联重复从226个减少到219个。

3.7. 通过突变体构建评估基因功能

通过构建EGDe EV P_AN和EGDe EV P_ANΔlmo1799突变体，研究人员证实lmo1799的过表达是强生物膜形成表型的关键因素。

研究结论表明，单增李斯特菌能够通过实验进化发展成为强生物膜形成菌株，其中Lmo1799的过表达起着核心作用。该蛋白通过改变细胞表面特性，特别是增加表面疏水性，从而增强细菌的附着和生物膜形成能力。这一发现不仅增进了我们对单增李斯特菌环境持久性机制的理解，也为开发控制该病原体的新策略提供了重要线索。值得注意的是，Lmo1799蛋白含有LPXTG细胞壁锚定基序和Ala-Asp串联重复序列，这些结构特征与已知的生物膜相关蛋白相似，表明其在细菌表面特性调节中可能具有保守功能。

这项研究的创新之处在于首次通过实验进化方法揭示了单增李斯特菌增强生物膜形成能力的进化路径，并确定了Lmo1799在这一过程中的关键作用。这些发现对食品工业中单增李斯特菌的控制具有重要应用价值，同时也为理解细菌环境适应性进化提供了新的视角。