加州大叶藻杂交种的低光适应性研究：从基因组学视角解析昼夜节律调控的光合作用机制

《Nature Plants》：Hybridization and low-light adaptability in California eelgrass (Zostera spp.)

本研究针对大叶藻（Zostera marina）恢复中因低光导致的高移植死亡率问题，通过基因组学和转录组学方法，鉴定并解析了Z. marina与深水物种Z. pacifica的杂交种。研究发现该F1杂交种在低光胁迫下通过上调光合系统基因、叶绿素生物合成及相关昼夜节律核心转录因子（如LHY、WNKs），维持光合作用活性，展现了优于Z. marina的低光耐受性，为利用杂交种进行生态恢复提供了新策略。

　　

在沿海生态系统中，大叶藻（Zostera marina）如同海底的草原，构筑着生机勃勃的水下世界。它们是海湾和河口的重要栖息地，为无数海洋生物提供庇护所，并发挥着净化水质、固碳和防止海岸侵蚀的关键作用。然而，这片重要的“海底草原”正面临严峻挑战。人类活动如疏浚、船舶航行和沿海开发，以及气候变化引发的环境变化，导致大叶藻床大规模消失。其中，富营养化引起的光照限制已成为大叶藻衰退和恢复失败的主要生理原因。

当光线不足时，大叶藻会代谢储存在根状茎中的非结构性碳水化合物（NSC）来维持生存。这些碳水化合物中约87%是蔗糖，因此Z. marina被誉为“海洋甘蔗”。但当光线持续低于光补偿点时，碳消耗超过碳同化，大叶藻的生存便受到威胁。特别是在生长季节经历的慢性或偶发性光照干扰，会耗尽大叶藻越冬前储存的碳水化合物，显著降低其存活率。

在这一背景下，加州斯克里普斯海洋研究所和索尔克生物研究所的研究团队将目光投向了另一种大叶藻——太平洋大叶藻（Zostera pacifica）。这种大叶藻是南加州湾的特有物种，生活在6-22米的深水区，其光照环境通常只有Z. marina最低生存需求的光合有效辐射（PAR）水平。Z. pacifica 的这种深水生存能力，使其成为研究大叶藻低光耐受性的理想案例。

研究人员在圣地亚哥Mission湾的Mariner's Basin发现了一个持久存在的杂交大叶藻床，这是2011年美国陆军工兵部队为缓解疏浚影响而进行的大叶藻恢复项目的产物。该地点最初移植了Z. marina和Z. pacifica的混合种群，如今则主要由Z. marina和杂交大叶藻组成。这一发现引发了研究团队的好奇：这个杂交种是否继承了Z. pacifica的低光耐受性？能否成为大叶藻恢复的新工具？

为了回答这些问题，研究团队开展了一项跨学科研究，成果发表在《Nature Plants》上。他们通过基因组和转录组分析，首次揭示了这个杂交种是Z. marina和Z. pacifica的F1代同源多倍体，并发现其在低光条件下通过调节昼夜节律相关基因，维持光合作用活性，展现出独特的低光响应机制。

研究团队运用了多项关键技术方法：通过全基因组测序（WGS）和单倍型解析技术构建了染色体级别的基因组组装；利用中宇宙实验模拟低光胁迫，对杂交种和Z. marina进行转录组分析；采用系统发育分析和同义替换率计算估计物种分化时间；通过基因本体（GO）富集分析鉴定差异表达基因的功能类别。实验样本包括从加州多个地点采集的野生大叶藻及Mission湾的杂交种群。

Identifying and sequencing a Zostera hybrid

研究人员首先通过形态学观察发现，Z. pacifica具有宽大叶片，而南加州的Z. marina叶片较窄，杂交种则表现出中间表型。通过基因组测序和K-mer分析，他们估计杂交种的二倍体基因组大小约为497 Mb，远高于Z. marina（303 Mb）和Z. pacifica（249 Mb），且杂合度更高。研究团队构建了杂交种的单倍型解析基因组，以及多个加州大叶藻的基因组组装。杂交种基因组组装具有高度连续性，单倍型1（Hap1）和单倍型2（Hap2）的支架N50分别为25.7 Mb和16.1 Mb。通过重测序分布在杂交区域的12个杂交个体，研究人员估计所有表现出特征性宽叶的杂交种都是克隆体。

在组装的杂交基因组中，Hap1-marina与Z. marina（Zmar913）对齐，Hap2-pacifica与Z. pacifica（Zpac1022）对齐，没有明显的编码序列重组迹象。Hap1-marina与Zmar913共享17,418个同线同源基因（占支架上基因的89.2%），Hap2-pacifica与Zpac1022共享17,304个（90.7%）。除了4号染色体上高度重复的着丝粒序列外，同源染色体之间没有明显的重排迹象，这表明杂交处于F1阶段，尚未发生明显重组。

Z. pacifica speciation

为了验证Z. pacifica是否可能是一个生态型而非独立物种，研究人员比较了Z. pacifica基因组与地理和表型相似的Z. marina。尽管叶片宽度是Zostera属的可塑性状，但全基因组K-mer聚类分析显示，所有Z. pacifica组装体都与加州的Z. marina明显分开，既不按地理邻近性聚类，也不按宽叶表型聚类，这支持了Z. pacifica是独立物种而非生态型的观点。

在Z. marina材料中，研究人员注意到1号染色体上存在一个持久的倒位。虽然2-6号染色体在全基因组中保持同线性，但1号染色体的倒位出现在南加州和中加州材料中。Z. pacifica不共享这种倒位，表明Z. pacifica的分化早于该倒位事件。然而，这种倒位确实导致杂交种在同源染色体之间存在内部倒位。

Z. pacifica基因组（组装为Zpac1022和杂交种Hap2-pacifica）比Z. marina略小，着丝粒区域的长末端重复反转录转座子（LTR-RTs）较少。通过查询29种开花植物构建的orthogroup，研究人员发现Z. pacifica中显著基因扩张的orthogroup很少，且具有基因本体（GO）注释信息的新基因几乎都是未转录的假基因。这表明Z. pacifica与Z. marina的分化不是由明显的拷贝数扩张驱动的，而是可能由基因功能进化和转录调控驱动。

Z. marina and hybrid transcriptomes diverge under low-light conditions

接下来，研究团队探索了杂交种及其Z. pacifica基因是否表现出与Z. marina不同的低光响应。他们进行了中宇宙生长实验，使杂交种和Z. marina经受5天的遮光处理，并在扰动前、中和后调查转录组。

实验设计模拟了持续数天至数周的海洋风暴或浮游植物水华造成的半黑暗环境。在正午阳光最强时，光限制水族箱接收的光合有效辐射约为37 μmol m^-2s^-1，积分日光照量小于1 mol m^-2d^-1，构成严重的遮荫条件。傍晚采样最大限度地减少了环境光干扰，并捕捉了植物对光合同化物饱足或饥饿的转录组响应。

通过将所有RNA-seq读数映射到杂交种转录组，研究人员发现杂交样本的平均映射率为69.8%，Z. marina为70.2%。为了在差异表达分析前消除单倍型交叉映射，他们使用近交系Z. marina和Z. pacifica的RNA-seq计算每个Hap1-Hap2同源基因对的转录本映射准确性。应用90%的映射准确性 cutoff 后，13,952对1:1同源基因被用于差异表达分析，代表了研究中观察到的85.4%的杂交种转录。

研究人员观察到，杂交种Hap1-marina单倍型的转录组范围内的转录本相对丰度模式与近交系Z. marina相似。杂交种中一部分基因在亲本单倍型之间表现出表达偏好。在所有条件下，叶片中的表达偏好高于根状茎，但不偏向某一个亚基因组。偏好表达均匀分布在整个基因组中，表明基因调控时间或强度的全基因组分化，而不是某个区域受到选择压力。

在13,952对高置信同源基因对集合中，研究人员进行了低光照条件下（t2和t3）与全光照条件下（t1和t4）植物的差异表达分析，并鉴定了描述杂交种和近交系Z. marina不同趋势的富集GO术语。

在两个组织类型中，叶片对低光强度的基因上调和下调反应更大，杂交种叶片上调了Hap1上的2,445个基因和Hap2上的2,481个基因，而Z. marina叶片上调了1,959个基因。相比之下，杂交种根状茎上调了1,073和1,062个基因，Z. marina根状茎仅上调了334个基因。

从上下调基因集中提取富集的GO分组发现，光感受基因（A）在Z. marina和杂交种中均发生上调和下调，但杂交种对红光或远红光和光周期的响应与Z. marina相比显著。蓝光感受在两种植物中均下调。在初级代谢和碳水化合物利用（B）方面出现了不同的趋势，随着植物对低光合同化物的响应，在傍晚采集时，杂交种上调了光合作用（富集度：Hap1为4.4，Hap2为4.7；错误发现率FDR <0.0001）。此外，叶绿素生物合成基因在杂交种叶片中高度富集（富集度8.2；FDR <0.0001），而未在Z. marina中富集。研究人员观察到Z. marina在根状茎中上调蔗糖分解代谢（富集度24.3；FDR <0.05），而杂交种也上调蔗糖分解代谢，但仅因Z. marina的差异表达基因数量较少，其富集度才具有统计学意义。由此确定，Z. marina和杂交种在遮荫胁迫下都会代谢一些根状茎糖分，但杂交种还维持光系统蛋白和叶绿素以进行光合作用，表明尽管PAR较低，光合作用仍在继续。在胁迫响应（C）方面，Z. marina和杂交种都上调和下调叶片对活性氧的响应。除此之外，它们的胁迫响应不同，杂交种在叶片中上调海藻糖代谢、免疫应答调控和生殖相转变，而Z. marina叶片上调胼胝质沉积、缺氧响应和光形态建成。最后，生长和发育基因（D）在杂交种和Z. marina中均表现出上调和下调，表明由于光照减少，通路开启和关闭混合存在。

Low-light photosynthesis in the hybrid leaf

虽然Z. marina通过代谢储存的根状茎糖分来响应实验性遮荫条件，但杂交种还上调了叶绿素生物合成和傍晚光合作用，表明昼夜节律调控转录的转变驱动了光系统的持续维护和隐含的光合同化物生产。

光捕获和叶绿素生物合成基因在低光照时间点t2（遮荫三天）和t3（遮荫五天）期间，在Hap1-marina和Hap2-pacifica同源基因上均表现出协同过表达。光捕获组分，包括几个LIGHT-HARVESTING COMPLEX A和B（LHCA和LHCB）、LOW QUANTUM YIELD OF PHOTOSYSTEM II 1（LQY1）和编码光系统II家族蛋白的PSB27的同源基因，在t2时高度表达，在t3时表达异质。其他光捕获组分——编码ATP依赖性锌金属蛋白酶的FTSH2和编码参与光系统II维护和回收的ATP非依赖性丝氨酸蛋白酶的DEGS——在t3时表达最高。尽管光捕获复合体转录本强烈上调，但质体与细胞核读数比率显示遮荫下叶绿体数量没有增加，表明杂交种通过上调LHC和光系统维护基因来修复或替换光系统组分以应对低光，而不是通过增加叶绿体密度。

关键的吸光色素叶绿素a和叶绿素b由谷氨酸生物合成，并与血红素生物合成共享一个卟啉支架中间体——原卟啉IX。叶绿素生物合成的几个关键生物合成组分在原卟啉IX的上游和下游均被上调，表明在血红素分支点前后均存在协同上调。这些包括早期途径的HEMA和HEMC（分别编码谷氨酰-tRNA还原酶GluTR和胆色素原脱氨酶PBGD的生物合成基因），以及下游途径的CHLI（编码镁-原卟啉螯合酶的一个亚基），以及镁原卟啉甲基转移酶（CHLM）和3,8-二乙烯基叶绿酸a 8-乙烯基还原酶（DVR）的基因。此外，编码叶绿酸a加氧酶的CAO催化叶绿酸a和叶绿酸b的相互转化，驱动叶绿素b的生物合成。虽然大多数组分在两个单倍型上都过表达，但一个HEMA同源物表现出向Hap1-marina的转录偏好，而显示在5号染色体上串联重复的HEMC，其两个拷贝偏向Hap2-pacifica。

虽然研究人员观察到光合作用和色素生物合成基因在亲本1:1同源基因之间相对平衡地过表达，但几个光周期基因在低光条件下表现出单倍型偏好。核心昼夜节律时钟转录因子基因LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）在两个单倍型上的低光条件下均上调，该基因通常具有早晨特异性、日间特定时间表达，当其结合光捕获复合体编码基因的启动子以促进转录和光敏色素信号传导时。在理想光照条件下，曾观察到Z. marina中LHY转录振荡在黎明前达到峰值，但研究人员在傍晚遭受低光的杂交种中测量到转录本上调。非生物信号通过信号通路到达昼夜节律时钟；脱落酸（ABA）信号先前已被认为与Zostera低光胁迫响应有关，研究人员注意到一个mRNA结合蛋白编码基因ABHI的两个拷贝，参与ABA信号的转录后调控，其过表达强烈偏向Hap2-pacifica。WITH NO-LYSINE KINASEs（WNKs）是参与将非生物胁迫信号整合到昼夜节律时钟定时的蛋白激酶，在水稻（Oryza sativa）和大豆（Glycine max）等单子叶植物中得到证实。三个WNK在低光杂交种中过表达，包括一个温带海草特有的4号染色体WNK1同源物，仅显示Hap2-pacifica同源物的低光差异表达，表明新功能化。WNKs也与ABA信号有关，但这些相互作用尚未完全阐明。WNK1也可能作用于开花时间基因（FTs），如TIME OF FLOWERING 1（TFL1），研究人员观察到该基因在此GO类别中上调，且重复间存在异质性。GO:光周期现象中涉及的较少研究的基因包括参与花表型的锌指同源域转录因子HB31和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶LRK10L3，每个在杂交种中都有多个拷贝，表现出单倍型偏好。

除了LHY，研究人员还观察到其他昼夜节律时钟转录因子在低光下上调，特别是那些组成促进光合作用的早晨环的因子，通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻的同源性鉴定。其中几个基因显示单倍型偏好。PSEUDO-RESPONSE REGULATORs（PRRs）被LHY激活并在早晨和中午表达，在Zostera中有三个同源物，其中两个表达并在杂交种的两个单倍型上上调。经典的LHY抑制子和晚间环的核心组成部分TIMING OF CAB EXPRESSION 1/ PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 1（TOC1/PRR1）在陆地植物中高度保守，但不存在于Zostera中。晚间复合体LUX ARRHYTHMO（LUX）上调，但EARLY FLOWERING 3或4（ELF3/4）的差异表达不显著。与LHY一样，ELF3/4和CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）同源物以及TIMING OF CAB EXPRESSION 1（TOC1）同源物在所有时间点都表现出单倍型偏好，LHY和一个CHE偏向Hap2-pacifica，另一个CHE和ELF偏向Hap1-marina。

这些昼夜节律基因大多数正在经历纯化选择，杂交种Hap1-marina和Hap2-pacifica同源基因之间的蛋白质序列同义替换率与非同义替换率之比（Ka/Ks）小于1。然而，上调的LHY、LUX、WNK5和TFL1正在经历正选择，Ka/Ks值分别为1.05、1.26、1.22和1.16。RNA-seq采集代表振荡器上的单个时间点。因此，结果支持一种日照长度转变的理论，这需要在未来的时间过程中进行测试。

讨论与结论

通过全基因组测序和解析的亲本染色体组装，研究人员描述了一个Zostera杂交种基因组景观，这是一个第一代F1同源多倍体，其Z. marina和Z. pacifica亲本单倍型尚未发生重组。单倍型解析的杂交种转录组能够在遮荫条件下比较Z. marina和Z. pacifica基因同源物。杂交种表现出与近交系Z. marina不同的低光响应，上调光系统和叶绿素生物合成；这种差异表达意味着在高于光补偿点的光强下持续产生光合同化物，这是耐荫性的表现。

在杂交种中观察到傍晚光合作用基因上调可能与光周期控制有关，因为研究人员观察到昼夜节律时钟转录因子、WNK蛋白激酶和ABA信号蛋白的差异表达。在遮荫条件下，研究人员观察到昼夜节律振荡器的早晨环在傍晚被上调。已知光照减少会延长昼夜节律周期，例如，在遮荫的番茄中LHY的相位提前两小时，并且杂交种单倍型已被证明可以解耦核心时钟基因的振荡。LHY在整个实验过程中表现出向Hap2-pacifica的表达偏好，表明Z. pacifica和Z. marina的时钟可能是异步的。

Zostera物种每个单倍型拥有一个LHY同源物。有假说认为Zostera中时钟基因的减少是由于水的可用性降低了选择性压力。研究人员提出，以深水生活的Z. pacifica为代表的温带海草的耐荫性，有利于一个具有灵活周期性的简化时钟。这些植物面临高度可变的光环境；风暴或浮游植物水华可能瞬时将PAR降至接近光补偿点，持续数天至数周，而季节性变化对生长设定长期限制，因此需要保留时钟调控的过程如开花。这种生活方式有利于一种对日长具有可塑性定义的植物，以便在短时间尺度的低光事件中利用所有光合可用光，同时在理想光照条件下保留时钟调控的转录。Zostera的昼夜节律时钟值得更深入的研究，以探索这些保守时钟基因在代谢日中作为低光恢复力重要参与者的潜在新功能化。

Mariner's Basin的Z. marina x pacifica杂交事件是缓解管理的后果。然而，如果有益性状如低光耐受性或来自杂种优势的高生长率在野外得到证实，该种群可能对恢复有用。在混合草甸中进行生态学研究，可以比较多个季节的初级生产力和草床扩张/收缩，以确定杂交种是否正在成为该地点的竞争优势种。长期的原地遮荫实验或在光挑战地点小规模实验性移植杂交种和Z. marina植株，结合连续PAR测量，可以探索存活率和生长率。此外，有性繁殖力这个关键问题仍然存在。优势杂交克隆似乎是第一代或F1，这与Z. pacifica在该地点移植的时间较近相符。虽然研究人员尚未观察到明确的杂种优势，但在2023-2024年未观察到开花后，2025年夏季，杂交种产生了生殖组织、花和种子，表明存在异交潜力。大叶藻可以产生广泛的克隆，尽管在南加州，这些克隆不如依赖一定量有性繁殖的基因混合床常见。目前尚不清楚该克隆的流行是由于低有性繁殖力还是由于其具有适应环境的竞争性基因型。发现杂交种是否产生可育种子，以及这些开花事件未来的频率，是理解其生态影响的优先事项。取决于这些性状，杂交种可以扩大适合大叶藻恢复的栖息地范围，允许在因深度、季节性事件或水质差而导致PAR降低的区域进行移植。

随着富营养化、疏浚和海平面上升导致海湾和河口水域大叶藻的PAR减少，光照限制将继续阻碍Z. marina的恢复努力。将大叶藻恢复扩展到包括近海Z. pacifica可能有益于南加州的沿海生态系统和碳捕获，但这需要进一步阐明Z. pacifica的生长参数以选择合适的恢复地点，而杂交种可能使之成为可能。Z. marina海湾和河口系统与Z. pacifica开阔海岸生态系统在基因含量和同线性上高度相似。对于比较研究，杂交种提供了一个包含两个基因组的克隆材料，以及对其生长率、繁殖和生存力的生态调查。