Piwi-piRNA复合物通过转录终止因子PNUTS和Senataxin启动转座子沉默的新机制

《Neuron》：The Piwi-piRNA complex initiates transposon silencing via transcription termination factors PNUTS and Senataxin

本研究揭示了果蝇卵巢中Piwi-piRNA通路启动转座子沉默的新机制。研究人员发现SFiNX复合物通过SUMO化的Panx招募Sov蛋白，进而结合转录终止因子PNUTS和Senataxin，导致RNA聚合酶II停滞，实现异染色质形成前的转录沉默。这项工作阐明了piRNA作为转录终止信号的新功能，为理解转座子沉默的起始机制提供了重要见解。

　　

在基因组中潜伏着大量的"跳跃基因"—转座子，它们如同基因组中的"暗物质"，既可能推动进化，也可能引发灾难。特别是在生殖细胞中，转座子的异常激活会导致基因组不稳定和遗传疾病。为了应对这一威胁，生物体进化出了PIWI蛋白和PIWI相互作用RNA（piRNA）这一精密的防御系统。

在果蝇卵巢中，Piwi-piRNA复合物能够引导转座子的转录沉默，这一过程通常伴随着异染色质标记H3K9me3的沉积和染色质压缩蛋白HP1a、H1的招募。然而，越来越多的证据表明，Piwi介导的沉默可能分为两个相对独立的步骤：起始和维持。虽然异染色质依赖的维持步骤已被广泛研究，但沉默起始的分子机制仍然是个谜。

为了解决这一科学问题，Wu等研究人员在《Molecular Cell》上发表了他们的最新发现。他们利用先进的λN-boxB拴定系统，揭示了Piwi-piRNA复合物通过招募转录终止机器来启动转座子沉默的全新机制。

关键技术方法

本研究主要采用卵巢体细胞（OSC）系和λN-boxB拴定系统，通过蛋白质质谱分析鉴定相互作用蛋白，利用RNA干扰（RNAi）和报告基因 assays 验证功能，结合RNA测序（RNA-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析转录调控机制。

SUMO化修饰在沉默起始中的关键作用

研究人员首先发现SFiNX复合物与SUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）密切相关。通过质谱分析λN-Panx和λN-Nxf2的免疫沉淀复合物，他们鉴定出果蝇中唯一的SUMO同源物Smt3与SFiNX复合物显著富集。

进一步的功能实验表明，SUMO化修饰对于Piwi-piRNA通路的沉默功能至关重要。敲低SUMO或其修饰通路中的关键因子（Ulp1、Ubc9、Su(var)2-10）会导致转座子mdg1的去沉默。重要的是，SUMO的缺失也破坏了λN-Nxf2和λN-Panx介导的报告基因沉默，证明SUMO化在沉默起始步骤中发挥重要作用。

研究人员特别关注了Panx蛋白的SUMO化修饰。他们发现Panx的N端无序区（IDR）中的四个赖氨酸残基（K6、K10、K82、K88）对于沉默活性至关重要。将这些位点突变为精氨酸（Panx-4KR）会完全破坏其沉默功能，而将SUMO直接融合到Panx-4KR的N端则可以恢复沉默活性，证明N端SUMO化是沉默起始的必要条件。

Sov作为分子支架连接沉默起始复合物

已知SUMO化的Panx能够招募含多个锌指结构域的大蛋白Sov。本研究证实Sov在沉默起始中发挥关键作用。敲低Sov会破坏Panx介导的沉默，而直接拴定Sov也能够诱导报告基因沉默，且这一过程不依赖于H1和HP1a，但依赖于SUMO。

有趣的是，Sov的N端结构域（SovN1）就足以介导沉默，而其C端的锌指结构域则不是必需的，表明Sov可能作为分子支架招募其他效应因子。

鉴定Sov相互作用蛋白和SUMO化靶点

为了揭示Sov的作用机制，研究人员通过质谱分析鉴定了λN-HA-3xFLAG-SovN1的相互作用蛋白。同时，他们建立了3xFLAG-SUMO-T86R细胞系，通过特异性抗体富集SUMO化肽段，全面鉴定了SUMO化修饰位点。

交叉分析发现23个蛋白既与Sov相互作用，又存在SUMO化修饰。其中，两个转录终止因子PNUTS（Phosphatase 1 Nuclear Targeting Subunit）和Senataxin（Setx）引起了研究人员的特别关注。

PNUTS-PP1-Wdr82复合物调控RNA聚合酶II延伸速度

功能实验表明，拴定PNUTS能够诱导报告基因沉默，且这一过程不依赖于H1、HP1a或SUMO。质谱分析发现PNUTS与Wdr82和三种蛋白磷酸酶1（PP1）亚型形成稳定复合物。

研究人员发现PNUTS通过其PP1结合基序（KKLTW，第722-726位氨基酸）招募PP1，点突变PNUTS-W726A会破坏与PP1的相互作用，导致沉默功能丧失。将Pp1-87B直接融合到PNUTS-W726A的C端可以恢复沉默活性。

ChIP-seq分析显示，拴定PNUTS会导致RNA聚合酶II在拴定位点附近积累，表明PNUTS-PP1-Wdr82复合物通过减缓RNA聚合酶II的延伸速度来促进转录终止。

Senataxin通过SUMO化和解旋酶活性双重机制促进沉默

另一方面，拴定Setx也能够诱导报告基因沉默，但这一过程依赖于SUMO。Setx包含一个N端的FHA结构域、中间的固有无序区和C端的两个解旋酶结构域。

研究人员鉴定出Setx的K183是主要的SUMO化位点。Setx-ΔC（缺失C端）的K183R突变会显著破坏沉默活性，而将SUMO直接融合到Setx-ΔC-K183R可以部分恢复功能。此外，Setx的119-124位氨基酸（EIVLSS）可能构成SUMO相互作用模体（SIM），与SUMO化修饰协同作用。

同时，Setx的解旋酶活性也对其功能至关重要。基于人类SETX的解旋酶死亡突变，研究人员构建了K1206R、D1391A和E1392A点突变，发现这些突变与K183R或SIM突变组合会显著破坏沉默活性。

ChIP-seq分析表明，拴定Setx会减少RNA聚合酶II在整个报告基因上的分布，包括转录起始位点，提示Setx可能通过促进转录终止来发挥功能。

研究结论与意义

本研究揭示了Piwi-piRNA通路启动转座子沉默的分子机制。研究人员发现SUMO化的Panx通过招募Sov蛋白，进而结合两个转录终止因子PNUTS和Senataxin，干扰RNA聚合酶II的转录过程，实现异染色质形成前的转录沉默。

这一发现的重要意义在于：首先，它阐明了piRNA可以作为转录终止信号，标记转座子区域用于转录终止；其次，它将转录终止机器与piRNA通路联系起来，为理解转座子沉默的进化提供了新视角；最后，这一机制可能不仅限于piRNA通路，其他沉默系统如HUSH复合物和KRAB-ZFP也可能采用类似的策略。

这项研究不仅深化了我们对转座子沉默机制的理解，也为研究其他类型的转录沉默提供了新的思路。未来，通过时间分辨率更高的实验系统，研究人员有望进一步揭示转录沉默的动态过程，包括转录起始、延伸和终止等各个环节的精细调控机制。