生物钟通过调控核糖体组成蛋白eL31的节律性整合促进翻译终止保真度与昼夜蛋白组多样性

《Cell Reports》：Circadian clock control of ribosome composition promotes rhythmic translation and termination fidelity

本刊推荐：为解决昼夜节律如何调控翻译保真度这一科学问题，Lamb等开展了关于生物钟控制核糖体组成蛋白eL31节律性整合的研究。研究发现，粗糙脉孢菌中eL31的昼夜节律性核糖体富集驱动了翻译终止保真度的节律性变化，并通过调控Mg2+稳态影响翻译延伸准确性。该研究揭示了生物钟通过重构核糖体组成来调控蛋白质合成质量的新机制，为理解昼夜节律调控蛋白质组多样性提供了新视角。

　　

当清晨的阳光透过窗帘，我们体内的生物钟已经开始协调成千上万个生理过程的昼夜节律。这种内在的时间维持机制不仅控制着我们的睡眠-觉醒周期，还精细调控着细胞内的分子活动。在分子层面，生物钟通过调控基因表达的多个环节——从转录到翻译——来产生约24小时的节律性输出。然而，一个长期未被探索的问题是：生物钟是否以及如何调控蛋白质合成的质量控制？

传统观点认为核糖体是均一的蛋白质合成机器，但近年研究发现核糖体其实具有异质性，其组成会随着细胞状态和环境变化而动态调整。这种核糖体组成的变化可以影响翻译的效率、特异性甚至准确性。与此同时，许多具有昼夜节律的蛋白质实际上来自组成型表达的mRNA，这提示我们：核糖体本身的昼夜节律性变化可能是一种重要的翻译调控机制。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，Lamb等人深入探索了生物钟是否通过调控核糖体组成来影响翻译保真度。研究团队选择粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)作为模型系统，这是一种研究昼夜节律和翻译控制的理想生物，具有保守的分子机制和丰富的遗传工具。

研究团队采用了多种前沿技术方法开展这项工作。他们通过质谱分析检测了不同昼夜时间点核糖体蛋白质组成的变化；利用核糖体图谱测序(RPF-seq)和RNA测序技术在全基因组范围分析了翻译和转录的节律性；通过体外翻译系统和双荧光素酶报告系统评估了翻译终止保真度；采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行元素分析；并运用荧光报告系统检测翻译延伸准确性。所有实验均在野生型、时钟基因突变体(Δfrq)和eL31基因敲除株(Δel31)中进行比较分析。

质量 spectrometry of ribosomes over circadian time shows rhythms in several ribosomal proteins

研究人员首先通过质谱分析发现在昼夜周期中，核糖体蛋白的化学计量比确实存在节律性变化。在野生型粗糙脉孢菌中，六个核糖体蛋白(eS17、eS19、eL14、eL31、eL33和eL37)和一个核糖体相关蛋白(ZUO)的含量表现出明显的昼夜节律，且在时钟基因突变体(Δfrq)中这种节律消失。这些蛋白的丰度均在傍晚/夜间达到峰值。特别值得注意的是，eL31在核糖体中的含量变化最为显著，从波谷到波峰有约40%的差异。

通过结构定位分析，研究人员发现这些节律性变化的核糖体蛋白并非随机分布，而是集中在特定功能区域。eS19构成核糖体小亚基的头部，eS17环绕头部基部并与支架蛋白RACK-1(在粗糙脉孢菌中称为CPC-2)相互作用。而eL31、eL14和eL37则形成簇状围绕在肽出口隧道(PET)周围，这一区域是新生肽链离开核糖体的通道，也是多种分子伴侣系统的结合位点。

Confirmation of clock-dependent eL31 abundance rhythm within ribosomes

为了验证质谱结果，研究团队构建了eL31-HA标签株，并通过蔗糖密度梯度离心证实eL31-HA确实被整合到单核糖体和多聚核糖体中。Western blot分析显示，虽然全细胞提取物中的eL31总量没有节律性变化，但核糖体中的eL31含量确实呈现昼夜节律，在主观傍晚达到峰值，且这种节律在Δfrq细胞中消失。这表明生物钟特异性地调控eL31向核糖体的整合，而非其总表达量。

Ribosome biogenesis factors important for the insertion of eL31 into developing ribosomes are clock controlled

eL31在核糖体中节律性富集但在全细胞提取物中无节律的现象提示，eL31向核糖体的插入过程可能受生物钟调控。在酿酒酵母中，eL31的核糖体整合需要eIF4G、Ssf1和Rrp15等生物发生因子的参与。研究人员发现，这些因子在粗糙脉孢菌中的表达同样具有昼夜节律，且峰值时间与核糖体中eL31的峰值时间相符。这表明生物钟可能通过调控核糖体生物发生因子来间接控制eL31的节律性整合。

Deletion of e/31 causes growth phenotypes, elevated stop codon readthrough, and lengthens the circadian period

为了探究eL31的生理功能，研究人员构建了eL31敲除株(Δel31)。与酿酒酵母中的表型一致，Δel31菌株表现出对低温(20°C)和氨基糖苷类抗生素帕罗霉素(paromomycin)的敏感性增加。通过双荧光素酶报告系统，研究人员发现Δel31细胞在帕罗霉素存在下表现出更高的终止密码子通读(SCR)水平，说明eL31对维持翻译终止保真度至关重要。

有趣的是，Δel31菌株仍能维持正常的生物钟振荡，但周期延长了约2小时。FRQ-LUC报告基因的节律周期从野生型的21.6小时延长到23.8小时，分生孢子发育节律也表现出类似的周期延长。这表明eL31虽然不影响生物钟的基本运行，但微调其速度。

Clock control of eL31 in ribosomes promotes rhythmic translation

通过核糖体图谱测序(RPF-seq)，研究人员发现Δel31严重影响节律性翻译。在野生型中有1,328个mRNA呈现节律性翻译，而在Δel31中，其中562个(42%)失去了翻译节律。这些失去翻译节律的基因主要富集在离子转运和其他转运功能相关类别。通过体内荧光素酶报告基因实验，研究人员进一步验证了三个特定基因(ENS3、GOL-9和TCF-14)在Δel31中翻译节律的减弱或消失。

深入分析发现，eL31依赖的节律性翻译基因中，60%源自组成型表达的mRNA，只有15%与mRNA本身的节律性丧失有关。这表明eL31主要通过翻译水平而非转录水平调控这些基因的节律性表达。此外，eL31与已知的翻译起始调控因子CPC-3(eIF2α激酶同源物)只有部分重叠，提示生物钟通过多种独立但互补的机制调控节律性翻译。

eL31 promotes clock control of translation termination fidelity

除了影响翻译的节律性，eL31还调控翻译终止的准确性。通过分析核糖体图谱数据，研究人员发现Δel31细胞在正常终止密码子(NTC)后区域有更高的读段密度，表明终止密码子通读增加。核糖体通读评分(RRTS)分析证实，Δel31细胞的终止密码子通读水平显著高于野生型。

更重要的是，研究人员首次发现翻译终止保真度本身存在昼夜节律。在野生型细胞中，白天的终止密码子通读水平显著高于夜间，而这种节律在Δfrq细胞中消失。Δel31虽然未完全消除这种节律，但显著减弱了其幅度。这种节律性变化在UAA和UAG终止密码子上尤为明显，而在UGA上不显著。

eL31 impacts translation fidelity through regulation of Mg homeostasis

一个令人困惑的发现是：Δel31核糖体在体外翻译实验中并未表现出内在的终止缺陷，提示体内观察到的通读增加可能不是由核糖体结构变化直接引起。研究人员注意到，体外翻译系统的终止密码子通读对Mg²⁺浓度高度敏感，Mg²⁺浓度的小幅增加(从3.9 mM到4.3 mM)可导致通读水平增加60%以上。

这一发现引导研究人员检测了细胞内Mg²⁺水平。令人惊讶的是，ICP-MS元素分析显示Δel31细胞中的Mg含量显著升高且节律性消失，而钾和钠水平降低。在野生型中，Mg含量呈现低振幅的昼夜节律，白天高、夜间低，这与核糖体中eL31的节律相反。

研究人员还发现，eL31缺失会影响翻译延伸保真度。通过GFP-mCherry双荧光报告系统，他们检测到Δel31细胞中甲硫氨酸误掺率显著增加，表明eL31对维持翻译延伸准确性也至关重要。

研究结论与意义

这项研究揭示了生物钟调控蛋白质合成质量的新机制：通过控制核糖体蛋白eL31的节律性整合，生物钟间接调控细胞内离子稳态，从而影响翻译保真度的昼夜变化。白天，核糖体中eL31含量较低，Mg²⁺水平较高，翻译错误率增加；夜间则相反，eL31含量高，Mg²⁺水平低，翻译保真度高。

这一发现具有多重重要意义。首先，它建立了核糖体异质性与昼夜节律调控之间的直接联系，扩展了我们对生物钟影响基因表达机制的理解。其次，翻译保真度的节律性变化可能是一种适应性机制，在特定时间点允许一定的翻译错误，从而增加蛋白质组的多样性，扩展基因组的功能范围。这种可控的蛋白质组多样性可能有助于细胞适应昼夜交替的环境变化。

从医学角度看，翻译保真度的下降与衰老和多种疾病相关，而生物钟功能随年龄增长而减弱可能是衰老过程中蛋白质稳态失衡的重要原因。维持生物钟对翻译保真度的调控可能有助于促进健康衰老。此外，eL31的人类同源基因与钻石-黑范贫血(Diamond-Blackfan anemia)等疾病相关，这提示生物钟可能通过类似机制影响人类健康。

该研究还提出了许多有待探索的新问题。例如，其他节律性核糖体蛋白(如eS17、eS19等)的功能是什么？eL31如何特异性地影响某些mRNA的翻译节律？这种机制在高等真核生物中是否保守？回答这些问题将进一步完善我们对生物钟调控细胞功能的理解。

总之，Lamb等人的工作揭示了生物钟通过重构核糖体组成来调控翻译保真度的精巧机制，为理解昼夜节律如何影响蛋白质组多样性和细胞适应提供了新视角。这一发现不仅深化了我们对基础细胞生物学的认识，也为相关疾病的机制研究和治疗策略开发提供了新思路。